1、實驗原理:

(1)、細菌生化試（shì）驗:

各種細（xì）菌所具有的酶係統不盡相同,對營（yíng）養基質的分解能力也不一樣,因而代謝產（chǎn）物或多或少地各有（yǒu）區別（bié）,可供鑒別細菌之（zhī）用.用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產物,從而（ér）鑒別細菌的種屬,稱之為（wéi）細菌的生化反應.

(2)、糖(醇)類發酵試驗:

不（bú）同的細菌含有發酵不同糖(醇)的酶,因而發（fā）酵糖(醇（chún）)的能力各（gè）不相同.其產生的代謝產物亦不相同（tóng）,如有的產酸產（chǎn）氣,有的產酸（suān）不產氣.酸的產生可利用指示劑（jì）來判定.在配製培養基時預先加入溟甲酚紫（zǐ）［P HS. 2(黃色)一6 . 8 (紫色)],當（dāng）發酵產酸時,可使（shǐ）培養基由紫色變為黃色.氣體產生可由發酵管中倒置的杜氏小管中（zhōng）有無氣泡來證明.

(3)、甲基紅（hóng）(Methylred)試驗(該試驗簡稱MR試（shì）驗):

很多細（xì）菌,如大腸杆菌等分解葡（pú）萄糖產（chǎn）生（shēng）丙酮酸,丙酮酸再（zài）被分解,產生甲酸、乙酸、乳酸（suān）等,使培養基的pH 降（jiàng）低到4 . 2 以下,這時若加甲基紅指示劑呈現紅色.因甲基紅指示劑變色範圍是pH4 . 4 (紅色)一pH6 . 2 (黃色).若某些細菌如產氣（qì）杆菌,分解（jiě）葡萄糖產生丙酮酸,但很（hěn）快（kuài）將丙酮酸（suān）脫梭,轉化成醇等物,則培養基的pH 仍（réng）在（zài）6 . 2 以上,故此時（shí）加入甲基紅指示劑,呈現黃色.

(4)、大分子物質代謝實驗:

靛基質(口引睬)試驗:

某些細菌,如大（dà）腸杆菌,能分解蛋白質中（zhōng）的色氨酸,產生靛基質(叫睬),靛基質與對二甲基氨基苯甲醛結合,形成玫瑰（guī）色（sè）靛基質（zhì）(紅色化合物).

硫化氫試驗:

某些細菌能分解含硫（liú）的氨基酸(肌氨酸、半（bàn）肌氨酸等),產生硫（liú）化氫,硫（liú）化氫與培養（yǎng）基中的（de）鉛鹽或鐵鹽,形成黑色沉澱硫（liú）化鉛或硫化鐵.為硫化氫試驗陽性,可借以（yǐ）鑒別細菌.

明膠液化實驗:

某些細菌具有膠原酶,使明膠被分解,失去凝固能（néng）力,呈現液體（tǐ）狀態,是為陽性.

粉（fěn）水解試驗(在紫（zǐ）外（wài）誘變中做,本實驗不做):

細菌對大分子的澱粉不能直接利用（yòng）,須靠產生的胞外酶(澱粉酶)將澱粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖),再被細菌吸收利用,細菌水解澱粉的過程可通過（guò）底物的變化（huà）來證（zhèng）明,即用碘（diǎn）測定不再產（chǎn）生藍色（sè）.

(5)、有機酸鹽及氨鹽利用試驗（yàn）:

檸檬酸（suān）鹽利用試驗:

檸檬酸鹽培養基係一綜合性（xìng）培養基,其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源.而磷酸二氫按是氮的唯一來源.有的細菌（jun1）如產氣杆菌（jun1）,能利用檸檬酸鈉為（wéi）碳（tàn）源,因（yīn）此能在檸（níng）檬酸鹽培養（yǎng）基上（shàng）生長,並分解檸檬酸鹽後產生碳酸鹽,使培養基變為堿性.此時（shí）培養基中的溟廖香草酚藍指示劑由（yóu）綠（lǜ）色變為深藍（lán）色.不能利（lì）用檸檬酸鹽為碳（tàn）源（yuán）的細菌,在該培養基上不生長,培養基不變色.

2、實驗（yàn）儀器,材料和用具:

(1)實驗儀器:

37℃恒溫培養箱、20℃恒溫（wēn）培養（yǎng）箱(室溫代替).

(2)微生物材料（liào）:

大腸杆菌、變形杆菌、枯草杆菌、產氣杆菌這四種菌種的斜（xié）麵各1支.

(3)試劑:

甲基紅試劑、VP試劑、叫噪試（shì）劑、格裏斯試劑(硝酸（suān）鹽利（lì）用試驗)、盧戈氏碘液(澱粉水解試驗（yàn）)

(4)實驗用具:

試管:每份（fèn）每個試驗2根（gēn）試驗（yàn）,1 根對照,8個試（shì）驗共27根（gēn）.

無菌平皿（mǐn）:每份2個

杜氏小管:每份6個.

接種環、酒精燈、試管架、記號筆.

(5)培養（yǎng）基:

①葡萄糖發酵培（péi）養基（jī）和乳糖發酵培（péi）養基:何份各6支（zhī）試管,何支5 一10mi 培養（yǎng）基,滅菌.用於糖類發酵試驗.

②葡萄糖蛋白陳水培養基:每份3 支試管,何支5一10mi培養（yǎng）基,滅菌.用於（yú）甲基紅和VP試驗.

③胰蛋（dàn）白水培養基:每份3支何支5一10mi培養基,滅菌.用於叫睬（cǎi）試驗.

④檸檬酸鐵錢或（huò）醋酸鉛的半固體培養基;每份3 支,每支5 一（yī）10ml 培養基,滅菌.用於硫化氫試驗.

⑤營養明（míng）膠培（péi）養基:每份3支,每支5一10ml培養基、滅菌.用於明膠液化試（shì）驗.

⑥澱（diàn）粉培養基:每份2個平皿,每平皿約20ml培養基,滅菌後倒入平皿.用於澱粉水解試驗.

⑦檸檬酸鈉培養基:每份3支,每支5 一10ml培養（yǎng）基,滅菌,做斜麵（miàn）.用於檸（níng）檬酸鹽利用試驗（yàn）.

3、實驗步驟:

(1)糖(醇)類發酵（jiào）試驗:

編號在（zài）各試管上分別標明發酵培養基（jī）名稱,所接種的菌名和組號,下同.

接種取葡萄糖發酵培養基（jī）3支,按編號1 支接種大腸杆菌,另（lìng）1支接種（zhǒng）普通變形杆菌,第3支不接種,作為對照C同樣取3支乳糖發酵培（péi）養基,1支接種大腸杆菌,1支接科普通變形杆菌,第3支不接種,作（zuò）為對照.

將己接種好的（de）培養基置37℃溫箱中培養24h.

觀察結果:被檢細菌若能發酵培養基中的糖時,則使培養基（jī）的pH 降低,這時培養基中的指示劑呈酸性反應(為黃色（sè）),若發酵培養基中的糖產酸產氣,則培養基不僅顯酸色反應,並且在培養（yǎng）基（jī）中倒（dǎo）置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體.氣體占整個倒置小玻管的10％以上.若被檢細菌不分解培（péi）養基中的糖,則培養（yǎng）基不發生變化.

(2)甲基紅（hóng）試驗(MR試驗):

將大腸杆菌和產氣杆菌分別接種到葡萄糖蛋白（bái）陳水培養基中,37℃培養48h,加甲基紅指示劑數滴,觀察結果（guǒ）,呈現紅色者為陽性,呈現黃色者為陰性.

(3)伏一（yī）普二氏試驗(VP試驗):

將被檢菌接種到葡萄糖蛋白陳（chén）水培（péi）養基中,37℃培養48h ,取出,加入40 % KOlls一10滴,然後再（zài）加入等量（liàng）的5％.一蔡酚溶液,用力振蕩,再放入（rù）37℃溫箱中保溫巧一30min ,以加快反應速度.若培養物呈現紅色,為伏一普反應陽性.

(4)靛基質(口引噪)試驗:

將被檢菌接種到胰蛋白陳水培養基中,37℃培養24h 一48h 後,沿試管壁滴加數滴叫睬試劑於培（péi）養物液（yè）麵,觀察結果.

出現紅（hóng）色者為陽性,出現黃色者為陰性.

(5)硫化氫試驗:

將大腸杆（gǎn）菌和變形杆菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或（huò）檸檬酸鐵氨培養（yǎng）基中,37℃培養24h ,觀察結果,若有黑色出現者為陽性.

(6)明膠液化試驗:

取大腸杆菌和枯草杆菌的（de）純培養物少（shǎo）許,以接種針分別穿（chuān）刺接種到營養明膠培養基中,置20℃培養5 一7 天.觀察明膠培養基液化情況.若被（bèi）檢細菌20℃不易生長,可放（fàng）37℃培養,但在此溫度下明膠培養基呈液狀,故觀察結果時,應將明膠培養基輕輕放入4℃冰箱30min ,此時明膠又凝固.若放置於冰箱30min仍不凝固者,說明明膠被（bèi）試驗細菌液化,是為陽性.

(7)澱粉水解試驗（yàn）:

將配製好的澱粉培養基冷卻到50℃左（zuǒ）右,以無（wú）菌操作（zuò）製成平板.

用接（jiē）種（zhǒng）環取少許枯草杆（gǎn）菌（jun1）劃線接種在平板的一邊（biān）,再取少許（xǔ）大（dà）腸杆（gǎn）菌劃線接種在平板的另一（yī）邊.置37℃溫（wēn）箱培養24h.

將平皿取出,打開（kāi）皿蓋,滴加少量盧戈氏碘液（yè）於平板上（shàng）,輕輕搖動平皿（mǐn）,使（shǐ）碘液均勻（yún）鋪滿整個平板.如菌苔周圍有無色透明圈出現,說明澱（diàn）粉（fěn）己被水解（jiě）.透明（míng）圈的大小,說明（míng）該菌水解澱粉能力的大小.

(8)檸檬酸鹽利用試驗:

取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養基上,37℃培養24h後,觀察結果.培養基變深藍色者為陽性.培養基不變色,則繼續培養7天,培養基仍（réng）不（bú）變色者為陰性.

本文關鍵詞：細菌鑒定（dìng）中常用的生理生化反應