1、傳（chuán）代保（bǎo）存法：有些微生物當遇到冷凍或幹燥等處理（lǐ）時，會很快死亡，因此在這種情況下，隻能求助於（yú）傳代培養保存法（fǎ）。傳代培養（yǎng）就是要定期地進行菌種轉接、培養後再保（bǎo）存，它是最基本的微生物保存法，例（lì）如酸奶等（děng）常（cháng）用生產菌種的保存。

傳（chuán）代保存時，培養基的（de）濃度不宜過高，營養成（chéng）分不宜過於豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的範圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低（dī）於最適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基（jī）中添加少量碳酸鈣。

一般地，大（dà）多數菌種的保（bǎo）藏溫度以5℃為好（hǎo），像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳代培養保存法雖然（rán）簡（jiǎn）便（biàn），但其缺點（diǎn）也很明顯，如：①菌種管（guǎn）棉（mián）塞經常容易發黴；②菌（jun1）株的遺（yí）傳性狀容易發生變異；③反複傳代時，菌株的病原性、形成生（shēng）理活性物質的能力以（yǐ）及形（xíng）成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種，工作量大；⑤雜菌的汙（wū）染機會較多（duō）。          

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2、液體石蠟覆（fù）蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長（zhǎng），適用於（yú）黴菌、酵母菌、放線菌（jun1）及需氧細菌等的保存。此法可防止幹燥，並通過限製氧的供給（gěi）而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點，同時（shí）也適用於不（bú）宜冷凍幹燥（zào）的（de）微生物（如產孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細（xì）菌如（rú）固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、紅（hóng）螺（luó）菌及沙門氏菌（jun1）等和一些真菌如卷黴菌（jun1）、小克銀漢黴、毛黴、根黴等不宜采用此法進（jìn）行保存。

3、懸液保存法：即使微生物混懸於適當溶液中（zhōng）進行保存的方法。常用的（de）有，

① 蒸（zhēng）餾水保存法：適用於黴（méi）菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌（jun1）體懸浮於蒸餾水中即可（kě）在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

② 糖液保存（cún）法：適用於（yú）酵母菌，如將其菌體懸浮於10%的蔗糖溶液中，然後於冷暗處保存，可長達10年。除此（cǐ）之外，也可使用緩（huǎn）衝液或食鹽水等進行保存（cún）。

4、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行幹燥保（bǎo）存的方法（fǎ）。常用的有方法包（bāo）括以下幾種，如（rú）

① 土壤保存法：主要用（yòng）於能形成孢子或孢囊的微生物菌種的（de）保藏。方法是在滅（miè）菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行幹燥或使菌體繁殖後再幹燥，然後冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以（yǐ）肥沃的（de）耕土為宜，土壤需風幹、粉碎、過篩和滅菌（jun1）。

使（shǐ）微生物在土壤中繁殖後進行幹燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置於塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基（以含水量為土壤最大持水量的60%為宜），然後（hòu）高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入幹燥器中經（jīng）短時間幹燥或風幹後密封，冷藏或室溫（wēn）保存。

② 砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒（lì），並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替（tì）清洗數次，幹燥後，置於試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經幹熱滅菌後，加入1ml菌種培養液，經充分混勻（yún）後，放入真空幹燥器中，完全幹燥後熔封保存。也可用二份洗淨（jìng）的砂（經HCl預處理）和（hé）一（yī）份貧瘠、過（guò）篩的（de）黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。

③ 矽膠保存法：以6～16目的無色矽膠代替砂子，幹熱滅（miè）菌後，加入（rù）菌液。加菌液時，由於矽膠的吸附熱（rè）常使（shǐ）溫度升高，因而需設法加以（yǐ）冷卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或（huò）多孔玻璃珠）後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的矽膠（或無水CaSO4），上鋪（pù）玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經幹熱滅菌後，接入菌懸液，最後冷藏、室溫保藏或減（jiǎn）壓幹燥後密封保藏。本法對酵母菌（jun1）很有效，特別（bié）適用於根瘤菌，可保（bǎo）存長達兩年半時間。

⑤ 麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水，經（jīng）滅菌後接種培養，最（zuì）後幹燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓（yā）或減壓幹燥後，置於裝有幹燥劑（jì）的容器內進（jìn）行（háng）保存（cún）。

5、寄主保（bǎo）存法：即令（lìng）微生物侵入其寄主後加以（yǐ）保存的方法。

6、冷凍保存法：適用於抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌（jun1）體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷（shāng），而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍（dòng）結還是在細胞內凍（dòng）結，都（dōu）會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點，

① 要選擇適於冷凍幹燥的菌齡細胞；

② 要（yào）選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨（suí）培養基成分的變化而顯示出巨大差異；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越（yuè）高，保存期也越長；

④ 最好在（zài）菌液內不添加電解質（zhì）（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液內添（tiān）加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現（xiàn）象。同樣，也可添（tiān）加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好（hǎo）保護效果的溶劑，但對有（yǒu）些微生物而言，不（bú）加保護劑時更（gèng）有（yǒu）效。

⑥ 原則上應盡快進（jìn）行冷凍處理，但（dàn）當（dāng）加入保護劑時，可靜置（zhì）一段時間後再進（jìn）行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應（yīng）在－20℃範圍內以1℃/min左右（yòu）的速度緩慢（màn）降溫，此後必須盡快降到貯（zhù）藏溫度；而對絕大多（duō）數微生物而言，則不必如此，如結構較為複雜（zá）的原蟲則可在－35℃範圍內進行（háng）緩慢降（jiàng）溫，而噬（shì）菌體則必需采用上述的（de）二階段法進行冷（lěng）凍；

⑧ 若（ruò）進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保（bǎo）存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當（dāng）冷凍菌融化後，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活（huó）率將顯著下降（jiàng）。

常用的冷凍保存法包括：

① 低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存（cún）時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌（jun1）液加量不宜過多，有些可添加（jiā）保護劑。此外，也可用φ5mm的玻（bō）璃（lí）珠來吸附菌液，然後把玻璃珠置於塑料容器內，再（zài）放入低溫冰箱內（nèi）進行保存的。

② 幹冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入幹冰內，再置於冰箱內進行冷凍保存。

③ 液氮保存法（－196℃）：是適用範圍最（zuì）廣的微（wēi）生物保存（cún）法。其操作步（bù）驟如下，

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮於含有適當防凍劑（保存黴菌不（bú）用防凍劑（jì））的滅（miè）菌溶液（yè）中，將0.2～1ml的這種溶液分裝於安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接（jiē）種，或將（jiāng）菌絲體瓊脂塊直接懸浮於分散劑中。

b、熔封安瓶管：若直接貯存（cún）於氣相液氮中（－150℃～－170℃）時，則（zé）不需（xū）熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安（ān）瓶管在適（shì）當的色素溶液中浸泡2～30分鍾後，觀察有無色（sè）素進入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置於（yú）小罐中，然後用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至（zhì）－25℃左右，也可（kě）在－20℃～－25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

e、速冷：最後浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

7、冷凍幹燥保存法：其原理是首先將微生（shēng）物冷凍，然後在減壓下利用升華現（xiàn）象除去水

分。事實上，從菌體中除去大部分水分後，細胞的生理（lǐ）活動就會停止，因此（cǐ）可以達到長期維持生命狀態的目的（de）。該方法適（shì）用於絕（jué）大多數微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存，其過（guò）程如圖6-1所（suǒ）示。

在進（jìn）行冷凍幹燥時，需注（zhù）意以下幾個問題（tí）：

a、冷凍幹燥前的培（péi）養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微（wēi）生物在營養豐富且容（róng）易增菌的培養基（jī）上進行培養為宜；菌齡以達到對（duì）數（shù）生長期為好；若為有芽孢或孢子（zǐ）的微生物，則以芽孢和（hé）孢子形成以後進（jìn）行保存（cún）為好；菌液濃度（dù）以高為好，如細（xì）菌（jun1）應達到109～1010/ml。

b、菌株號碼等的標記：可在安（ān）瓶外側標記（jì）或在安瓶內封入標簽。

c、安（ān）瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水衝洗（xǐ）3次後，蒸餾水刷淨，幹燥，塞棉塞，貼標簽，幹熱滅菌或溫熱滅菌後，60℃恒（héng）溫幹燥。

d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖（táng）的普通肉湯（tāng）以及加7.5%葡萄糖的血清等等（děng）。

8、Bordelli氏法：取幹淨的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛（niú）乳洗脫（tuō）試管斜麵上的菌苔，製成濃厚菌懸液。然後用無菌吸管將菌（jun1）懸液（yè）滴入小試管底部。每管一滴，然（rán）後轉動小試管使菌液分（fèn）散在試管底（dǐ）部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試（shì）管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。

本文關（guān）鍵詞：菌株的保藏方法