一、目的和內容

目（mù）的：學習從土壤中分離微（wēi）生物的（de）方法,學習無（wú）菌操作技術.

內容：

1．用稀（xī）釋法分離細菌、放線（xiàn）菌和黴菌.

2．用平板（bǎn）劃線方法分離微生物.

3．學習斜麵接種及穿刺接種等無菌操作技術.

二（èr）、材料和用具

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜麵菌種.

牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶,49.5mL無菌（jun1）水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.

無菌培養皿12套,1mL無菌（jun1）移液（yè）管10支,土壤樣品及天（tiān）平、稱量紙（zhǐ）、藥勺、試（shì）管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡（pào）)、玻璃（lí）刮.

三、操作步驟

(一)土壤稀釋分離：

1、取土壤（rǎng）：取表層以下5—10cm處（chù）的土樣,放入無菌（jun1）的袋中備用（yòng）,或放在4℃冰箱中暫存.

2、製備稀釋液(要無菌操作)

(1)製備土壤懸液：

稱土樣0.5g,迅速（sù）倒入帶（dài）玻璃（lí）珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力（lì）最好),振蕩（dàng）5～10min,使土樣充分打散,即成為10-2的土壤懸液.

(2)稀（xī）釋：

用無（wú）菌移液管吸10-2的土壤懸液（yè）0.5mL,放入（rù）4.5mL無菌水中即（jí）為10-3稀釋液,如（rú）此重複,可依（yī）次製成10-3～10-8的稀釋液(圖 3-1).注意：操作時管尖不能接觸液麵,每（měi）一個稀釋（shì）度換（huàn）用一支（zhī）移液管,每次吸入土液後,要將移液管插入液麵,吹吸3次,每次吸上的液麵要高（gāo）於前（qián）一次,以 減少稀釋中的誤差.

3、混菌法測定菌落數的方法（fǎ）

(1)細菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL,分別接人相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.然後取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養基,分別倒入以上培養皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜),迅速輕（qīng）輕搖動平皿,使菌液與培 養基充分混勻,但（dàn）不沾濕皿的邊緣,待瓊脂凝固即成細（xì）菌（jun1）平板.倒（dǎo）平板時要注意無菌操作.

(2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液5～6滴,搖勻,靜置片刻,然（rán）後分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中,選用高氏1號培養基,用與細菌相同的方法倒入平皿中,便可製（zhì）成（chéng）放線（xiàn）菌平板.

(3)黴菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別（bié）接入相應標號的（de）平皿（mǐn）中（zhōng）,每個（gè）稀釋度接兩個平皿.在融化的土（tǔ）豆蔗糖培養基中,每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕輕搖勻,然（rán）後用與（yǔ）細菌相同的方法倒入平皿中,便可製成黴菌的平板.

4、培養：將接種好的細菌、放線菌（jun1）、黴菌平（píng）板倒置（zhì）,即皿蓋朝下放置,於28～30℃中恒溫培養,細菌培養1～2d,放線菌（jun1）培（péi）養5～7d,黴菌培養3～5d.觀察生長的菌落,用於進一步純化（huà）分離或直接轉接（jiē）斜麵.

(二)平板製作及劃線分離方（fāng）法：

1．倒（dǎo）平板：按無菌（jun1）操作（zuò）要求,在火焰旁操作,做法如3(1).

2．劃線分（fèn）離：使用接種環,從待（dài）純化的（de）菌落或待分（fèn）離的斜麵菌種隻沾取少量菌樣,在相應培養（yǎng）基平板中劃線分離,劃（huá）線的方法（fǎ）多樣,目的是獲得單個菌落（luò）,.

(三)斜麵接種和穿刺接種：

1．斜麵接種

(1)取新鮮固體（tǐ）斜麵培養（yǎng）基,分別做好標記(寫上菌（jun1）名、接種日期、接種人等),然後用無菌操作方法,把待接菌種接入以（yǐ）上新鮮培養基（jī）斜麵上.

(2)接種的方法（fǎ）是,用接種環沾取少量待接菌種,然後在新鮮斜麵上“之”字形劃線,方（fāng）向是從下部開始,一直劃至上部(圖3—4A).注意劃線要（yào）輕,不可把培養基劃破.

(3)接種後（hòu）30℃ 恒溫培養,細菌培養48h,放（fàng）線菌（jun1）、黴菌培養至孢子成熟方可取（qǔ）出保存.

2．穿刺接種

(1)取兩支新鮮半（bàn）固體牛肉膏蛋白腖（dòng）柱狀培養基,做好標（biāo）記(寫上菌名)、接種日期,接種人等).

(2)接種（zhǒng）的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然後從柱狀培養基的中心穿入其底部(但不要穿（chuān）透（tòu）),然後沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要（yào）移動.

(3)接種（zhǒng）後30℃恒溫培養, 24h後觀察,比較兩種菌的生長結果.

四、注意事（shì）項

1．一般土壤中（zhōng）,細菌最多,放線菌及黴菌次之,而酵（jiào）母（mǔ）菌主要見於果園及菜園土壤中,故從土壤中分離（lí）細菌時,要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計數.

2．在土（tǔ）壤稀釋（shì）分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計數準確.

3．放線菌的培養時間較長,故製平板的培養基用量可適當增多.

五、實驗結果

記（jì）錄土壤稀（xī）釋分離結果,並計算出每克土壤中的細菌、放線菌和黴菌的數量.

計算方法：選擇長出菌落數30～300之間的培養皿進行計數,按以下公式：

總（zǒng）菌數/g=同一稀釋度幾次重複的菌落平（píng）均數×稀釋倍（bèi）數

本（běn）文關鍵詞：土（tǔ）壤的稀（xī）釋分離、純化微生物及無菌操作技術