目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿（jiǎn）性複紅法、副品（pǐn）紅法、結晶紫法、維多利亞藍（lán）B法、鍍（dù）銀染色（sè）法和熒光蛋白染色法6類，前5類方（fāng）法的媒染劑（jì）成分中均含有單（dān）寧酸，染色原理通常是采用不穩（wěn）定的膠（jiāo）體溶液做媒染劑，並（bìng）使其（qí）沉（chén）澱於鞭毛上而使“鞭毛（máo）腫脹（tar and feather）”，鞭（biān）毛（máo）直徑加粗，進一步染色後即可在油鏡下觀察。

1. 堿性複紅法（fǎ）和副品紅法

1926年由Gray首創，其媒染液成分（fèn）包括20%丹寧（níng）酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞（gǒng）水溶液2ml，3%堿性（xìng）複紅乙醇（chún）（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾後方可使用。染片時，媒（méi）染劑染色約6min，具體（tǐ）時間尚需在試驗中摸索（suǒ）確定，染（rǎn）色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸複紅染液，染（rǎn）片時需要1小片吸水紙蓋在塗片上（shàng），染色3min。由於該方法媒染劑混合物不穩定、操作複雜、經驗性強。Leifson於1930年建立了副品紅法，並於1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶（róng）液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解於100ml95%乙醇溶液中。使用時（shí）把等體積A和B混合，然後再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個（gè）月。

2. 結晶紫法，又稱（chēng）Ryu法

1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒（méi）染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和（hé）10 ml飽和（hé）硫酸鉀鋁（lǚ）。染色劑：飽和結晶紫乙醇（chún）溶液，即12g結晶紫溶於100 ml無水（shuǐ）乙醇中。使（shǐ）用時把10份媒染劑（jì）與1份染色劑（jì）混合，染（rǎn）色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片（piàn）技（jì）術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定（dìng），目（mù）前Difco公（gōng）司已經研製出該方（fāng）法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.

3. 維多（duō）利亞藍（lán）B法

1990年由Inoue等報道日（rì）本製藥株式會社Shionogi Seiyaku研製出一種細菌鞭毛染色（sè）商（shāng）品（pǐn）試劑盒。其試（shì）劑組成包括維多利亞藍（lán）B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑（jì）保存期約為6個月，關於其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒（méi）有采用評分法進（jìn）行評價，很難判斷其染色效果。

4. 鍍銀染色法

1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立（lì）了一種細菌鞭（biān）毛鍍銀染（rǎn）色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染（rǎn）液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉澱，通（tōng）過搖動（dòng）又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑（hēi）色溶液，穩定10 min後（hòu）使用。銀染液（yè）：配製5%AgNo3水（shuǐ）溶（róng）液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃（nóng）氨水（比重0.880）使形成的（de）沉澱剛（gāng）好重新溶解，最後把備用的（de）10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動後呈（chéng）現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避（bì）光保存，可穩定數（shù）周。用（yòng）媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌後，再把銀染液滴加至塗片上。加熱至接近沸騰（téng），染色3～5min。

由於Rhodes鍍銀染（rǎn）色法（fǎ）媒染液成分複雜（zá）、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細（xì）菌鞭毛鍍銀染色法的配（pèi）方。試劑A：100 ml蒸餾水（shuǐ）中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他（tā）同於（yú）Rhodes，但試劑不穩定，要（yào）求在4h內使用，並用要用氨水調pH至10。試（shì）劑A染（rǎn）片2～4min，試劑B染色30 s，不需（xū）加熱。

由於以上兩種鍍銀染色方法（fǎ）都要使用營養瓊脂（zhī）斜麵培養物，並且（qiě）需用無菌（jun1）蒸餾水懸浮菌液製片，未采用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等（děng）對（duì）鍍銀染色法進一步（bù）改良（liáng），製備塗片時直接使用血平板，評價染（rǎn）色效（xiào）果（guǒ）首次使用5分（fèn）製，通過該評價方法證明了（le）加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配製同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液（yè）染片4min，銀染液滴加至塗片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色（sè）效果評價，包（bāo）括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜（xié）麵，其中半固體動力培（péi）養基和（hé）TSA斜麵25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果（guǒ）血瓊脂平板35～37℃，培（péi）養（yǎng）18～24h不適（shì）於細菌鞭毛染（rǎn）色，而半固體動力培養基和TSA斜（xié）麵25℃，培養18～24h適合於細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福（fú）爾（ěr）馬林處（chù）理標本製備塗片（piàn）並不能有效阻止鞭毛脫落。

由於鍍（dù）銀染（rǎn）色（sè）法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年Porter等（děng）繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，隻是媒染劑避光室溫可保存數月（yuè），延長媒染劑（jì）染（rǎn）色時（shí）間為8 min，染色液不需加熱，隻染30 s，製備塗片程序略有不（bú）同。使用（yòng）TSA平板，36℃培養24h，但遺（yí）憾的是Porter等隻使用了1種細菌（奇異變形杆菌）進行研究。

於是1994年（nián）Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，並使用4種細菌（綠（lǜ）膿假單胞、奇異變形杆（gǎn）菌、黏質（zhì）沙雷菌、枯草芽孢杆（gǎn）菌），用（yòng）trypitcase soy肉湯及其瓊脂平（píng）板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒（méi）染液放置1、2、4、8、16周後進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染（rǎn）色30～60 s，不需（xū）加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。

5、鞭毛（máo）的（de）負染

具體操作：菌懸液，直接滴在銅網上，1－2分鍾後，吸去多餘的菌液（似幹非幹的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶（róng）液，1分鍾後，吸去多餘的染液，然後就可以在電鏡下觀察了。一般染色後十五天之內（nèi）看電鏡。時間太長（zhǎng）效果不好。這是我試驗用的方法。

曾做過一段時間（jiān）的細菌鑒定，以下是一些染色心（xīn）得：

首先染色用玻片一（yī）定要幹淨，洗液（yè）泡過之後蒸餾（liú）水衝洗幹淨。塗（tú）片的時候（hòu）菌千萬別塗得太多。第（dì）一部染色時，可將玻片置於水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上（shàng）蓋（主要是保持一定的濕度，防止染（rǎn）色液變幹（gàn）不利於衝洗，這步非常有用)。一定要（yào）將第一步使用的媒染液衝洗幹淨，否則影（yǐng）響染色效果，背景可能（néng）非常 髒。其他（tā）的步驟參考書上的資料進行，一般沒什麽問題。我用（yòng）這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事項（xiàng）：

1. 要注（zhù）意培養條件和培養（yǎng）時間：①用點接法在新配製的牛（niú）肉膏（gāo）蛋白腖半固體平（píng）板上（shàng）接種。一般（bān）一（yī）個平板點接3～4處。經比較用半固體培養基（jī）培養出來的菌體活（huó）動度大，鞭毛長且多，易於染（rǎn）色，這可能與半固體培養基更適於菌體運（yùn）動（dòng）、鞭毛生長較好有關。用點接種法在平板上（shàng）接種更易於挑取邊（biān）緣（yuán）幼齡的菌（jun1）體。②培養（yǎng）時間要（yào）嚴格掌握，一般培養9～12h較好，菌齡超過（guò）15h，鞭毛（máo）染色（sè）效果較差，這可能與老齡菌體活動度降低、鞭毛易（yì）脫落（luò）有關。

2.染色過程（chéng）中的細節也應充分注意：①取菌要（yào）取菌落（luò）邊緣的幼齡菌體。②取菌後（hòu）的接種環在（zài）載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要（yào）用力太猛，更不能用接種環大幅度塗開；將載片稍傾（qīng）斜，使菌液散開即可，否（fǒu）則鞭（biān）毛易脫落，造成（chéng）染色失敗。③鞭毛染色的玻片隻能自（zì）然幹燥，不能用熱風吹幹，不能熱固定，這是由於加熱後菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。④A染液染3～5 min，其後用蒸餾水（自來水效果差）衝洗時（shí）一定要充分（fèn），否則加B染液後，背景很髒，鞭毛不易被觀察到，影響實驗效果。⑤加B染液後，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸幹）使（shǐ）其微冒蒸汽，30～60 s，染色效（xiào）果較不加熱為好。⑥B染液染完後，用（yòng）蒸餾水（shuǐ）衝洗比用自來水衝洗效果好。

本（běn）文關（guān）鍵（jiàn）詞：細菌鞭毛染色的方法