RNA酶保護法是近十年發展起來的一種全新的mRNA定量分析方法（fǎ）。其基本原理是將標記的特異RNA探針（zhēn）（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜（zá）交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與（yǔ）目的基因特異性結（jié）合，形成（chéng）雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成（chéng）寡核糖（táng）核（hé）酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合後形成雙鏈RNA，免（miǎn）受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保（bǎo）護實驗（yàn）。

目錄（lù）

· 一、 RNA酶（méi）保護試驗的介紹

· 二、試劑準備

· 三、操（cāo）作（zuò）步驟

· 四、電（diàn）泳與放射自顯（xiǎn）影

· 五、注意事項

· 六、技術（shù）文（wén）檔

RNA酶保護試驗是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。

一、 RNA酶保護試驗的介紹

RNA酶保護試驗（RNase Protection Assay，RPA） 是通過液相雜交的方式，用反義（yì）RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern blot和RT-PCR比（bǐ）較，RPA有以下幾個優（yōu）點：

1. 檢（jiǎn）測靈敏度比Northern雜交高。由於Northern雜交步驟中轉膜和洗膜（mó）都將造成樣品（pǐn）和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜（zá）交體係進行電泳，故損失小，提高了靈敏（mǐn）度（dù）。

2. 由於PCR擴增過程中效率不均一和反應“平台”問題，基於PCR產物量進（jìn）行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此（cǐ），分析的數據真實性較高。

3.由於（yú）與（yǔ）反義RNA探針（zhēn）雜交的樣品RNA僅為該（gāi）RNA分子的部分片段，因此，部（bù）分降解的RNA樣品仍可進行分析。

4.步驟較少，耗時短（duǎn）。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。

5. RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身（shēn）複性問題，無須封閉。

6. 一個雜交體係中可同時進行多（duō）個探針雜交，無競爭性問題。

7. 檢測分（fèn）子長度可（kě）以任意（yì）設置，靈活性大。

RPA的缺點是需要同位素標記探針。

二、試劑準備

1. GACU POOL：取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 雜交緩衝液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化（huà）液：5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.RNase A（10mg/ml） 8μl.RNase T1（250U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2ml

三、操作步驟

（一） 反義RNA製備

可（kě）由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模（mó）板製備，也可以用含啟動子的PCR產物為（wéi）模板製備，本文介紹後者。

1.設計含T7啟動子的PCR引（yǐn）物

由於PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下遊（yóu）引（yǐn）物5’-端要含T7啟動子（zǐ）序列: T7啟動子（zǐ）序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設計的其他要求與一（yī）般（bān）PCR引物的設計相同（tóng）。PCR產物的長度決定了反義（yì）RNA探針的長度，具體設計（jì）時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即（jí）先擴（kuò）增出（chū）一較長的片段，再以該（gāi）片段為模板擴增出較短的片段，以（yǐ）保證探針（zhēn）的特異性，如下圖所示（shì）

2.PCR 先用上遊引物和下遊引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產（chǎn）物為模板（bǎn），用（yòng）上（shàng）遊引物（wù）和下（xià）遊引物Ⅱ-T7進行二次PCR。

3.探針合成標記與純化

在（zài）0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP.CTP.ATP各2.75 mM，UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μl

DTT （二硫蘇糖醇，0.1M） 1μl

5×轉錄（lù） buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 （15U） 1μl

混合後（hòu），短（duǎn）暫（zàn）離心，37℃保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl） 1μl， 37℃ 15min， 然後75 ℃ 10min以滅活（huó）DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶（méi）。

加入：飽（bǎo）和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中，加（jiā）入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉（zhuǎn）移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl，預冷無水乙醇250μl，混勻後，-20℃靜（jìng）置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉澱用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min， 棄上（shàng）清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩衝液（yè）溶解（jiě）沉澱，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。

（二） 雜交

1.RNA提取後溶解在雜交緩衝液中，濃度為1μg/μl。

2.取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整） 於0.5ml 離心管中。

3.80℃保溫2min，然後40-45℃下雜交12-18hr。

（三） 消化

1.雜交管於37 ℃保溫15min，加入RNase消化液（yè），37 ℃保溫30min。

2.加（jiā）入（rù）10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白（bái）酶K 20μl，混勻，37 ℃保溫10min。

3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

4.轉（zhuǎn）移上層（céng）液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異（yì）丙醇，混勻後，置-20℃ 30min，4 ℃離心，135000g×10min。

5.棄上清液，室溫下揮發（fā）乙（yǐ）醇，加入5-8μl上（shàng）樣緩衝液（yè）溶解沉澱（diàn）。

四、電泳與放射（shè）自顯影

（一） 配製凝膠（jiāo）：（50ml）

40%丙烯酰胺-亞（yà）甲雙丙烯酰胺（àn）（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加（jiā）H2O至50ml

溶解後加入（rù）25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混（hún）勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

（二） 預電泳（50ml）

以1×TBE為上下槽電（diàn）泳緩衝液，加上電壓後進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 ℃。待膠板溫度達50 ℃時，暫停電泳，準備加樣。

（三） 加樣

將已（yǐ）溶解在（zài）加樣緩衝（chōng）液中的樣品80 ℃加熱2min，立即加樣到（dào）膠（jiāo）孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳） 。

（四） 電泳結束

電泳結束後，打（dǎ）開膠板，用濾紙取下膠（jiāo），覆上一層（céng）保鮮膜，放置於暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光（guāng）結束後，將X光片顯影.定影.水洗.晾幹。

五、注意事項

1.本實驗大部分為RNA操（cāo）作，注意RNA酶的汙染。

2.RNase消化（huà）液消化（huà）未雜交的單（dān）鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時（shí），錯配位（wèi）點也將被（bèi）消化，因此會產（chǎn）生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時（shí），采取盡量減少（shǎo）錯配的措施。

3.同位素對RNA合成有一定影響，有時（shí）會（huì）產生非全長（zhǎng）的探針。因此，標記時間不宜過長。

4.RNase消化液有時會產（chǎn）生（shēng）過度消化而無檢測信（xìn）號，可（kě）以將消化液稀釋10-100倍後（hòu）使用。

本文關鍵（jiàn）詞（cí）：RNA酶保護試驗方法