範圍

本標（biāo）準規定了水產品中（zhōng）磺胺嘧（mì）啶、磺胺甲（jiǎ）基嘧啶、磺胺二甲（jiǎ）基嘧啶和磺胺（àn）甲基異噁唑（zuò）殘留量的液相（xiàng）色譜測定方法。

本標準適用（yòng）於水產品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺（àn）二甲基嘧啶和磺胺甲基異（yì）噁唑殘留量的測定，其它磺（huáng）胺類藥物的測定可以參照本標準。

規範性引（yǐn）用文件

下列文件中的條款通過（guò）本標準的引用而成為本標準的（de）條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改（gǎi）單(不包括勘（kān）誤的內容)或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各（gè）方研（yán）究是否可使用這（zhè）些（xiē）文件的最新版本。凡是不注日（rì）期的引用（yòng）文件，其最新版（bǎn）本適用（yòng）於本標準。

GB/T6682分析實（shí）驗（yàn）室用水規格和試驗方法

原理

用乙酸（suān）乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧（mì）啶為內標物，內標法定（dìng）量。

試劑

本（běn）標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處應無幹擾峰，實驗用（yòng）水應符合GB/T6682中一級（jí）水標準（zhǔn）。

標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶（dìng），純度均（jun1）大（dà）於98.0%。

丙（bǐng）酮：色譜純。

正己烷：色譜純（chún）。

乙酸乙酯：色譜純。

乙腈：色譜（pǔ）純（chún）。

甲醇：色譜純。

熒光胺：純度大於99.0%。

乙酸鈉：分析純。

冰乙酸：優級（jí）純。

鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水並稀釋至1000mL。

乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶於蒸餾水中，定容至100mL。

熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮（tóng），振搖至完全溶解，存（cún）放在暗處。現（xiàn）配（pèi）現用。

標準儲備液：100mg/L，稱取（qǔ）標準品10mg(稱準至0.1mg)，用（yòng）甲醇溶解並定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一（yī）個月。

混合標準中間液：1mg/L，移取標（biāo）準儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋並定容至100mL，在室溫下混勻。

內標儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解並定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

內標中間液：1mg/L，移取內標儲備液1.00mL，用甲醇稀（xī）釋並（bìng）定容至100mL，在室溫下混勻。

混合標準使用液：取混合（hé）標準（zhǔn）中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內標中間液100μL，用2mol/L鹽（yán）酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分（fèn）別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標準使用液（yè），其中內標濃度為0.05mg/L。

儀器與設備

液相色譜儀：配熒光檢測器。

電子天平：感量0.0001g。

電子天平：感量0.01g。

高速組織搗碎機。

均質機。

離心機。

旋渦混勻器。

氮吹儀。

往複式振蕩器。

聚丙烯離心管：15mL、50mL。

容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。

玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

巴斯德（dé）吸（xī）管。

色譜條件

色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

柱溫：45℃。

流動相：乙腈（jīng） 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調節pH至3.0配製成乙酸溶液（yè）。

流速：1mL/min

進樣量：20μL。

激發波長：405nm。

發射波長：495nm。

步驟分析

樣品製備

從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少（shǎo）於500g樣品，混勻，均分成兩（liǎng）份。裝入清潔容器，加封，標明（míng）標記。-18℃以下冷凍保存。

提取

將樣品解凍（dòng），稱取2.00g，置於（yú）50mL聚丙（bǐng）烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標（biāo）準中（zhōng）間液(4.16)100μL，用玻璃（lí）棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質機14000rpm均質1min，往複式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯（zhǐ）層小心轉移到（dào）15mL具塞刻度試管中，40℃以下（xià）氮氣（qì）吹至（zhì）2mL。再向原離心管中加（jiā）入乙（yǐ）酸（suān）乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸（suān）乙酯層小心轉移到原15mL具塞刻度試管（guǎn）中，40℃以（yǐ）下氮氣吹至5mL。然（rán）後（hòu）在試管中加（jiā）入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混（hún）勻1min，加蓋後振動10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在餘液中加入（rù）正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用（yòng）巴斯德吸管移去（qù）正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液（yè）備用（yòng）。

衍生

向樣品瓶中加入200μL混合標準使用液或樣品提取液（yè）、200μL乙酸鈉溶液（yè）和80μL熒光胺（àn）溶液，旋渦混勻30s，20min後供液相色（sè）譜分析。

色譜分析

取衍生後的樣（yàng）品提取液20μL進樣，記錄峰麵積，響應值均應在（zài）儀器檢測的線性（xìng）範圍之內。根據標準樣品的保留時間定性，內（nèi）標法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參見附錄A。

工作曲線

稱（chēng）取空白（bái）樣品2.00g，分（fèn）別添加（jiā）混合標準（zhǔn）中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別（bié）為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺（àn）峰麵積與內標物峰麵積的比值（zhí）為縱坐標，磺胺含量為（wéi）橫坐標，繪製工作曲線。

計算

用（yòng）色譜數據處理軟件或按下式計算樣品（pǐn）中磺胺殘留（liú）量（liàng）：

式中：

X——樣品中磺胺殘留量，單位（wèi）為毫克（kè）每千克(mg/kg)；

s——樣（yàng）品溶液中磺（huáng）胺峰麵積，單位為counts；

s1——樣（yàng）品溶液中內標峰麵積，單位為counts；

S——標準溶液（yè）中（zhōng）磺（huáng）胺峰麵積，單位（wèi）為counts；

S1——標（biāo）準（zhǔn）溶液中內標峰麵積，單位為counts；

x——加標（biāo）樣品中磺（huáng）胺殘（cán）留量，單位為毫克每千克（kè）(mg/kg)。

方法回收率

濃度範圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見回收率表（biǎo）。

回收率表

名稱

回收率

磺胺嘧啶

88.0%～111.8%

磺胺甲基嘧啶

90.0%～110.8%

磺胺二（èr）甲基嘧啶

91.0%～110.1%

磺胺甲基異噁唑（zuò）

107.0%～116.7%

方法檢（jiǎn）出限

本方法檢出限為0.010mg/kg。

精密度

在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果（guǒ）的絕對差值不得超過算術平（píng）均值的15%。

本文（wén）關鍵詞：液相色譜法 水產 磺胺含量