傳統的（de）蛋白鑒定方法，如免疫（yì）印跡法、內肽的化學測（cè）序、已（yǐ）知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達通常耗時、耗力（lì），不適合高流通量的篩選。 目（mù）前，所選用的技術包括對於蛋白鑒定的圖象分析、微量測序、進一步（bù）對肽片段進行鑒（jiàn）定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。

1  圖象分析技（jì）術（Image analysis）

“滿天星”式的2-DE圖譜分（fèn）析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎（chǔ）的數據處理，進行定量（liàng）分析。 在（zài）一係列高（gāo）質量的2-DE凝膠產生（低背景染色，高度的重複性）的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比（bǐ）和數據庫構建。 首先（xiān），采集圖象通常所用的係統是電荷耦合CCD（charge coupled device）照相機；激光密度儀（yí）（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，對圖象進行數字化。 並成為以象素（pixels）為基礎的空間和網（wǎng）格。 其次，在圖象灰度水平上（shàng）過（guò）濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測。 利（lì）用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意義的區域與背景分離，精確限（xiàn）定（dìng）斑（bān）點（diǎn）的強度、麵積、周長和方向。

圖象分析檢測（cè）的斑點須（xū）與肉眼（yǎn）觀測（cè）的斑（bān）點一致。 在這一原則下，多數係統（tǒng）以控製斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟件可精確描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。 通過閾值分析、邊（biān）緣檢測、銷蝕和擴（kuò）大斑點檢測的基本工具還可恢複共遷移的斑點邊界。 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老（lǎo）的Unix為基礎的2-D分析軟件包（bāo）。 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增（zēng）加、消減或均值（zhí）化。 由於在2-DE中（zhōng）出現（xiàn）100%的重複性是很困難的，由此凝（níng）膠間的蛋白質的配比對於圖象分析（xī）係統是一個挑戰。 IPG技術的出現已使斑點配比變得容（róng）易。 因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算（suàn）法在長度和平行度觀測。 用來配比的著名軟件係統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等（děng）級分類和主（zhǔ）要因素分析已（yǐ）被（bèi）采用，而神經網絡、子波變換（huàn）和實用分析在未來可被采用。 配比通常由（yóu）一個人操作，其手工設定大約（yuē）50個突（tū）出（chū）的斑點作為（wéi）“路（lù）標”，進行交叉配比。 之後，擴展至整（zhěng）個膠。

例如（rú）：精確的PI和（hé）MW（分子量）的估計通過參考圖（tú）上20個或更多的（de）已知蛋白所組（zǔ）成（chéng）的標（biāo）準曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在（zài）凝膠圖象分析係統依（yī）據已知蛋白（bái）質的pI值產生PI網絡，使得凝膠上其（qí）它蛋白的PI按此分配。 所估計的精確度大大（dà）依賴於（yú）所建網格的結構及標本的類型。 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標誌，變性的（de）修飾的蛋白的（de）PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子（zǐ）量可以從數（shù）據庫中計算，利用產生的表觀分（fèn）子量的網格來估計（jì）蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯誤（wù）率大約30%，而翻譯後蛋白的出入更大。 故需聯合其他的技術完成鑒定。

2  微量測序（microsequencing）

蛋白（bái）質的微量測（cè）序已成（chéng）為蛋白質分析和鑒定的基（jī）石，可以提供足夠（gòu）的信息。 盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜（PMF）可（kě）鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解（jiě）仍然是進行鑒定的主要技術。 目前已實現蛋白質微量測序（xù）的自動化。 首先（xiān）使經凝膠分離的蛋白質直（zhí）接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上（shàng），染色、切割，然後直接置於測序儀中，可（kě）用於subpicomole水平的蛋白質的鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生；與質譜相比，Edman降解消耗大（dà）；試劑昂（áng）貴，每個氨基酸花費3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分（fèn）析成百上千的蛋白質。 然而，如（rú）果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其（qí）基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序。

近來，應（yīng）用自動化的Edman降解可產生短（duǎn）的N-末（mò）端序列標簽，這是將質譜的（de）序列標簽概念用（yòng）於Edman降解，業已成為一（yī）種強有（yǒu）力的蛋（dàn）白質鑒（jiàn）定。 當對（duì）Edman的硬（yìng）件（jiàn）進行簡單改（gǎi）進，以迅（xùn）速產生N-末端序列標簽達（dá）10～20個/d，序列檢簽（qiān）將適於在較小的蛋白質組中（zhōng）進（jìn）行（háng）鑒定。若聯（lián）合其他（tā）的蛋白質（zhì）屬性，如氨（ān）基酸組（zǔ）分分析（xī）、肽質質量（liàng）、表（biǎo）現蛋（dàn）白質分子量、等電（diàn）點，可以更加可信地（dì）鑒定蛋（dàn）白質。 選擇BLAST程序，可與（yǔ）數據庫相配比。 目前，采用一種Tagldent的檢索程（chéng）序，還可（kě）以進行（háng）種間比較（jiào）鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用。

3  與質譜（mass spectrometry）相關的技術

質譜已成為（wéi）連接（jiē）蛋白質與基因的重要技術，開啟了大（dà）規模自動化的蛋白質鑒（jiàn）定之門。 用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主（zhǔ）要的部（bù）分，1）樣品入機的離子（zǐ）源（yuán），2）測量被介入離（lí）子的分子量的裝置。 首先（xiān）是基質輔助激光解吸附電離飛行（háng）時間質譜（MALDI-TOF）為一脈衝式的離子化（huà）技術。 它從（cóng）固相標本（běn）中產生離子，並在飛（fēi）行管中測其分子量。 其（qí）次（cì）是電噴霧質譜（ESI-MS），是一連續（xù）離子化的方法，從（cóng）液相（xiàng）中產（chǎn）生離子，聯合四極（jí）質譜或在飛行（háng）時間檢測器中測其分子量。 近（jìn）年來，質譜的裝置和技術有了長（zhǎng）足的進展。

在MALDI-TOF中，最重要（yào）的進（jìn）步是離子反射器（qì）（ion reflectron）和延（yán）遲提取（delayed ion extraction），可達相當精確的分子量。 在ESI-MS中，納米級電霧（wù）源（nano-electrospray source）的（de）出現使得微升級的樣品在30～40 min內（nèi）分析成為可能。

將反相液相色譜和串聯質（zhì）譜（pǔ）（tandem MS）聯用，可在數十個picomole的水（shuǐ）平檢測（cè）；若利用毛（máo）細管色譜（pǔ）與串聯質（zhì）譜聯用（yòng），則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當（dāng）利用毛細管電（diàn）泳與串聯質譜連用時，可在小於femtomole的水平檢測。 甚至可在（zài）attomole水平進行。 目前多為酶（méi）解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用鑒定蛋白質。 下麵以肽質指紋術和肽片段的測序來說（shuō）明怎（zěn）樣（yàng）通過（guò）質譜來鑒定蛋白質。

(1)肽質（zhì）指紋（wén）術（peptide mass fingerprint， PMF）

由Henzel等人（rén）於1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）對由2-DE分離的蛋白（bái）在膠上或在膜上於精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產（chǎn）生的精確（què）的分子（zǐ）量通過質譜來測量（MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS），這一技術能夠完成的肽質量可精確到0。1個分子量（liàng）單位。 所有的肽質量（liàng）最後與數據庫中理論肽質量相配比（理論肽是（shì）由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產（chǎn）生的（de））。 配比的結果是（shì）按（àn）照數據庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，“冠軍”肽片段可能代表一個未（wèi）知蛋（dàn）白。若冠亞軍之間的肽（tài）片段存（cún）在較大差異，且（qiě）這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。

(2)肽片段（peptide fragment）的部分測序

肽質（zhì）指紋術對其自身而言，不能揭（jiē）示所衍生的肽片段或蛋白質（zhì）。 為進一步鑒定蛋白質，出現了一係列的質譜方法（fǎ）用來描述（shù）肽片段。 用（yòng）酶或化學方（fāng）法從N-或C-末端按（àn）順序除去氨基酸，形成梯形肽片段（duàn）（ladder peptide）。 首先以一種可控製的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一係列的梯形肽片段，所得一定數（shù）目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。 另一種方法涉及羧基（jī）肽酶的應用，從C-末端除去不同數目（mù）的氨基酸形成肽片段（duàn）。 化學法（fǎ）和酶法可產生相對較長的序列（liè），其分子量精確至以區別賴氨酸（128。09）和穀氨酰胺（128。06）。 或者，在質譜（pǔ）儀內應用源後衰變（post-source decay， PSD）和碰撞誘導解離（collision-induced dissociation， CID），目的是產生包含有僅異於一（yī）個氨基酸殘基質量的一係列肽峰的質譜。 因此，允許推斷肽片（piàn）段序列（liè）。 肽片段PSD的分（fèn）析在MALDI反應器（qì）上（shàng）能產生部分序列信息。 首先進行肽質指（zhǐ）紋鑒定。 之後，一個有意義的肽片段在質譜儀被選作“母（mǔ）離子”，在飛行至離（lí）子（zǐ）反應器的過（guò）程中降解為“子離子”。 在反應器中，用逐漸降（jiàng）低的（de）電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。 但經常產生不完全的片段。 現在（zài）用肽（tài）片（piàn）段來測序的方法始於70年代末的CID，可以一個三聯四（sì）極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成。 在（zài）ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的（de）第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至（zhì）第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得（dé）產（chǎn）物在第三個四極質（zhì）譜中測量。 與（yǔ）MALDI-PSD相比，CID穩定、強健（jiàn）、普遍，肽離子片段基本（běn）沿著酰胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續的（de）片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量。 由此（cǐ），序列可被推測。 由CID圖譜還（hái）可獲（huò）得的幾個序列（liè）的殘基（jī），叫做“肽序列標簽”。 這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端（duān）的（de）距離將（jiāng）足以鑒定一個蛋白質。

4  氨基酸組分分析

1977年首（shǒu）次作為（wéi）鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的（de）“腳印”技（jì）術。 利用蛋白質異質性的氨基酸組分（fèn）特征，成為一種獨立於序列的屬性，不同於肽質量或序列標簽。 Latter首次表明氨基酸（suān）組分的數據能用於從2-DE凝（níng）膠上鑒定（dìng）蛋白質。 通過（guò）放射標記的氨基酸來測定蛋白（bái）質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟（zhòu）的氨基酸的提取，每一（yī）樣品的氨基酸在40min內自（zì）動衍生並由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周。 依據代表兩（liǎng）組分間數目差異的分（fèn）數，對數據庫中（zhōng）的蛋白質進行排榜，“冠軍”蛋白質具有與未知蛋（dàn）白質最相近的（de）組（zǔ）分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差（chà）異（yì），僅處於冠軍的蛋白質的（de）可信度大。 Internet上存在多個程（chéng）序可用於（yú）氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在（zài）PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質（zhì）。 但仍存在一些缺點，如由於不足的酸（suān）性水解或者部分降解會產生氨基酸（suān）的變（biàn）異。 故應聯合（hé）其他的蛋白質屬性進（jìn）行鑒定。

本文關鍵詞：蛋白鑒定方法