1、純（chún）化的一般目標（biāo）和方法

首先，自然（rán）來源或者（zhě）重組表達的蛋白質（zhì）經過（guò）一些粗提的步驟(例如：勻漿、離（lí）心、硫酸銨沉澱等)成為穩定的可以用於（yú）色譜分離的樣品。

然後（hòu）進行捕獲色譜(capture chromatography)，主要目標是濃縮和去除（chú）大量的容（róng）易去（qù）除的雜質，此步最關心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝（níng）膠。

經過濃縮的部分純化的樣（yàng）品進行中級色譜(intermediate chromatography)，目的（de）是去除較難去除的雜質，此步最關心的是分辨率，常采用高分辨率的細顆粒（lì）凝膠。

最後為了得（dé）到符合要求的最終（zhōng）產品，去除殘（cán）存的雜質以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進行（háng）精製色譜(polishing chromatography)，常采用（yòng）具有高分辨率的凝膠過濾凝膠（jiāo）進行凝膠過濾色譜。

2、純化前的準備工作

(1)樣品穩定性試驗a、測定樣品（pǐn）在pH 2-9的（de）穩定性（xìng）；b、測定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸（suān）銨中的穩定性；c、測定樣品在0-50%乙醇（chún）、甲醇中的穩定性；d、測定樣（yàng）品（pǐn）在4-40℃的（de）穩定性；e、室（shì）溫（wēn）下靜置過夜，測（cè）定對蛋白水解酶的穩定性（xìng）。

(2)樣品預處理a、去除（chú）樣（yàng）品（pǐn）中顆粒物(0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鍾)

b、去除樣品中（zhōng）脂類( 10000 g離心15分鍾或有機溶（róng）劑抽提)

c、去除樣品中（zhōng）核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉澱)

d、抑製樣（yàng）品中蛋白（bái）水解酶(加入蛋白酶（méi）抑製劑、低溫下快速第一步分（fèn）離或在蛋（dàn）白酶缺陷宿主中表達重組蛋白)

(3)樣品的保存條件：短期儲存(小（xiǎo）於24小時)

a、避（bì）免接近或超過樣品的穩定極限防止蛋白質變（biàn）性或沉澱b、在密閉容器中冰箱冷藏（cáng）較長期儲存(數（shù）天)

a、b、同上c、加入適當的抑菌劑長期儲存a、同上b、冰凍或者最好凍幹(真空冷凍幹燥)保存。

3、對每（měi）一純化（huà）步（bù）驟的評價相關方（fāng）法的建立

a、目的蛋白含量測定酶活性測定（dìng）、生物活性測定、放射免疫、酶聯免（miǎn）疫、免疫電泳、熒光。

b、總蛋白含量測定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結合法(考馬斯亮蘭G-250)等。

c、樣品複雜（zá）度檢測HPLC(離子交換、凝膠過濾（lǜ）、反相)、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳(CE)。

4、蛋白質的（de）來源（yuán）

(1)天然蛋白： 天然產物中的目的蛋白一般含量很（hěn）少（shǎo）而且（qiě）組分極複雜，在分離過程中須采用多（duō）步驟才能去除各種雜質，並應在整個過程中降（jiàng）低蛋白水解酶（méi）的活性。

(2)重組蛋（dàn）白： 重組蛋白則目標蛋白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表（biǎo）達定位：

a、細胞質：在種情況下，必須破（pò）壞細胞結構才能得到目的蛋白質，同時伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質的釋放（fàng）；在表達量較高的條件（jiàn）下，一般形（xíng）成包涵體，包涵體含有過表達目的（de）蛋白，且容易通（tōng）過高速離心（xīn）分離，但是包（bāo）涵體的溶解（jiě）與（yǔ）複性是較複雜的。

b、外周質： 表達的蛋白質存在於細菌內（nèi）膜與外膜（mó）之間，這樣目的蛋白可以較少地受到（dào）蛋白酶的作用並減（jiǎn）少了宿主蛋白的汙染。

c、分（fèn）泌到（dào）培養基：這種（zhǒng）表達一般蛋白質濃度較低，主要受到培養基中的汙染。

本文關鍵詞：蛋白質、多肽液相色譜純化