黃曲黴毒素B1免疫（yì）親和柱操作說明書

【概要】

黃曲黴毒（dú）素（Aflatoxin）是黃曲黴、寄生曲黴等真菌產生的次級代謝產物，被世（shì）界衛生組（zǔ）織的癌症研究機構劃分為（wéi）1類致癌物，同時又是一種毒性極（jí）強的劇毒物質，廣泛（fàn）存在於各種食（shí）物中（zhōng）。玉米，花生，大（dà）米，小麥等穀（gǔ）物（wù）及其副產品（pǐn）是黃曲黴毒素的主要來源，同時飼料中的（de）黃（huáng）曲黴毒素（sù）B1經過（guò）動物代謝後產生的（de）黃曲黴毒素M1仍然具有很強（qiáng）的（de）毒性（xìng）和致癌性，也廣（guǎng）泛（fàn）存在牛奶，血液，組織等食品（pǐn）中。黃（huáng）曲黴毒素作為肝（gān）癌（ái）的三（sān）大誘因之一（yī），也是誘（yòu）發胃癌，腸癌（ái）等疾病（bìng）的主（zhǔ）要原因（yīn）之一，對人類的健康構成很大威脅。世界各國對食品，飼料（liào）中的黃曲黴毒素都有嚴格的限量標準。

【適用（yòng）範圍及性能】

用於定性、定量檢（jiǎn）測穀物、副食（shí）品、酒類等食品和（hé）飼料等樣本（běn）中的黃曲黴（méi）毒素總量B1時的樣品前處理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【試驗（yàn）原理（lǐ）】

本產品的（de）測定的（de）基礎是抗原抗體反應，黃曲黴毒素B1單克隆（lóng）抗體連接（jiē）在柱內凝膠上，樣品中（zhōng）的黃曲黴毒素B1經過提（tí）取、過濾（lǜ）、稀釋，然後將樣品提取液緩慢的通過黃曲黴毒素B1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內，毒（dú）素與（yǔ）抗體結合，之後洗滌免疫親和柱除（chú）去沒（méi）有被結合的其他物質。用甲醇（chún）洗脫（tuō）黃（huáng）曲黴毒素（sù）B1，然後注入到分析（xī）儀器中用於檢測。

【包裝組成】

根據不同（tóng）規格，每一個盒中包含5-25支黃曲黴毒素免疫親和（hé）層析柱（zhù）及1份說明書。

【需要而（ér）未提供（gòng）的設備及試劑】

設備：

┅┅高速均質器（qì）或組織勻漿機

┅┅粉碎機

┅┅200ml/50ml量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅微量移液器：單道（dào） 100l～1000l

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅玻璃微纖維濾紙（1.5m孔徑）

┅┅50ml漏鬥

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵（bèng）流操作架（jià）（包括空（kōng）氣泵，不同容積（jī）的玻璃注射器等）

試劑（jì）：

┅┅甲醇（chún）（色譜（pǔ）級）

┅┅蒸餾水（shuǐ）或去離子水

┅┅pH7.0磷酸鹽緩衝溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純（chún）水溶解，然後用濃鹽酸調節pH值至7.0，最後用純水稀釋至1000mL

┅┅吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩衝溶液並定容至1000mL

【試劑配製】

樣品提取液：根據不同的樣品配置不同濃度的甲醇水（shuǐ）溶液，作為（wéi）樣品（pǐn）提取液。

【樣本處理步驟】

（一（yī））花生（shēng），玉米，大米，小麥及其（qí）製品（pǐn），植物油脂和飼料

┅┅取25g粉碎（suì）的樣品（植物油脂直接取樣（yàng），無需處理）與125mL甲醇-水（7：3）溶液混合；

┅┅加入5.0g氯化鈉以均質器高速（sù）攪拌，提（tí）取2分鍾；

┅┅4000r/min離心5min或用槽紋（wén）濾紙過濾；

┅┅取15mL濾液並加入（rù）30mL水稀釋，用玻璃微纖維（wéi）濾紙過（guò）濾，取稀釋後液體待測；

┅┅將免疫親和柱連接於20.0mL玻（bō）璃注射器下。準確（què）移取15.0mL樣品提取（qǔ）液注（zhù）入玻（bō）璃注射器；

┅┅將空氣壓（yā）力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空（kōng）氣通過柱體；

┅┅以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，並使2mL~3mL空氣通過柱體；

┅┅準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液於玻璃試管中，供檢測用。

（二（èr））醬油

┅┅取50g試樣與100mL甲醇-水（8：2）溶液混合；

┅┅加（jiā）入2.5g氯化鈉以均質器高速攪拌，提取1分鍾；

┅┅4000r/min離心5min或（huò）用槽紋濾紙過濾；

┅┅取10mL濾液（yè）並加入40mL水稀釋，用玻璃（lí）微纖維濾（lǜ）紙過濾

┅┅取稀（xī）釋後液體待測；

┅┅將免疫（yì）親和柱連（lián）接於10.0mL玻璃注射器下（xià）。準確移取10.0mL樣品提取液（yè）注入玻璃注射（shè）器；

┅┅將空氣壓力泵與玻（bō）璃注射（shè）器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次（cì），棄去全部流出液，並使2mL~3mL空氣通（tōng）過柱（zhù）體；

┅┅準確加入1.0mL色譜（pǔ）級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集（jí）全部洗脫液於玻璃試管中，供（gòng）檢測用（yòng）。

（三）食醋

┅┅取（qǔ）5g試（shì）樣，加入1.0g氯化鈉；

┅┅以pH7.0磷酸鹽緩衝溶液稀釋定容至25.0mL；

┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；

┅┅取10mL濾液並加入（rù）10mL水稀釋（shì），用玻璃微纖維濾紙過濾

┅┅取稀（xī）釋（shì）後液體待測。

┅┅將免疫親和柱連接於10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL樣（yàng）品提取液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力（lì）泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫（yì）親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以（yǐ）10.0mL水淋（lín）洗柱子2次，棄去全部流出液，並使2mL~3mL空氣（qì）通過（guò）柱（zhù）體；

┅┅準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為（wéi）1 mL/min ~2mL/min，收（shōu）集全（quán）部洗脫液於玻璃試管中，供檢測用。

【結果判定（dìng）】

經免疫親和柱淨化後（hòu），收集到的甲醇洗脫液（yè）可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯免疫試（shì）劑盒進行檢測。收集到（dào）的1mL洗脫液中的黃曲黴毒素B1含量相當於1g樣品中黃曲黴毒素B1含量。

【高效液相參考譜圖】

【注意事項】

┅┅黃曲黴毒素危害極大，應戴手套（tào）操（cāo）作。

┅┅使用過的玻璃容器及黃（huáng）曲黴毒素溶（róng）液最好用5%濃度次氯酸鈉溶液浸泡過夜。

┅┅不要（yào）使用過了有效（xiào）日期的免疫親和柱。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱可於常溫保（bǎo）存，2-8℃儲存可延長有效期，不可凍存（cún）

保存期（qī）：該產品有效期為12個月（yuè）。