黃曲黴毒素B1 （Ⅰ型）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃（huáng）曲黴毒素（sù）是曲黴菌屬的黃曲黴和寄生曲（qǔ）黴的二次（cì）代謝產物，是自然界最危（wēi）險的致癌物質之一，廣泛存在於穀物、堅果、棉（mián）籽以及以此為原料生產的各種食品、油料、酒類、飼料中，並能通過動物體產生（shēng）同樣有害的代謝產物，存在於牛（niú）奶及奶製品，肉類甚至人體血液，組織中。

黃曲（qǔ）黴毒素（sù）中毒性最強的是黃曲黴毒素B1，是世界衛生組織規定的I類致癌物質，毒性是砒霜的68倍，其幾乎一直和（hé）黃曲黴毒素B2、G1 和 G2共（gòng）存，是肝癌的三大致（zhì）病因素之（zhī）首。世界大部分國家和地區都已對食品和飼料中的黃曲黴毒（dú）素最高允許水平作了規定，因此，準確測定食品及飼料中的黃曲黴毒素（sù）含量（liàng）對於食品安全監控具有重要意義。

【適用範圍】

可定性、定量檢（jiǎn）測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲（qǔ）黴毒素B1。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預包被黃曲黴毒素B1抗原，加入樣本/黃曲黴毒素B1標準（zhǔn）品溶液及辣根過氧化物酶標（biāo）記的黃曲黴毒素B1抗體。樣本或標準品溶液中（zhōng）的黃曲黴（méi）毒（dú）素B1與預包被在微孔（kǒng）板上的黃曲黴毒素B1抗原競爭結合辣根過氧化（huà）物酶（méi）標記的黃曲黴毒素B1抗（kàng）體。未結合的酶標抗體在洗滌（dí）時被除去。再加（jiā）入（rù）TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與（yǔ）其所含殘留物黃曲黴毒（dú）素B1的含量成負相關。對照（zhào）標準曲線，即可得出相（xiàng）應殘留物黃曲黴（méi）毒素B1的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.1ppb

【交叉反應（yīng）率】

   結（jié）構類似物                                                                  交叉反應率

  黃曲黴毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲黴毒素B2   ……………………………………………………………   15%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………   11%

  黃曲黴毒素G2   ……………………………………………………………    4%

  黃曲黴毒素（sù）M1  ……………………………………………………………  0.5%

【試劑盒（hé）組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 酶（méi）標物1瓶  ……………………………………………  6ml

4. 顯色（sè）液1瓶（píng）  …………………………………………… 12ml

5. 終（zhōng）止液1瓶  …………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶  …………………………50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 …………………… 50ml

【需（xū）要而未提供的（de）設備及試劑】

設（shè）備：

┅┅微孔（kǒng）板酶（méi）標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅氮吹儀

┅┅粉碎機

┅┅離心機（jī）

┅┅天平（píng）：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl

試劑：

┅┅甲醇（分（fèn）析純）

┅┅石油（yóu）醚

┅┅去離子水（或蒸餾水（shuǐ））

┅┅三氯（lǜ）甲烷

┅┅NaCl

【試劑配製】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去（qù）離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份（fèn）去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液（yè）用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮（suō）洗滌液+9份去離子水）。

3. 穀物稀（xī）釋（shì）液（yè）：將（jiāng）0.9gNaCl用配製完成的樣品稀釋液溶解並定容至100ml。

4. 啤酒稀釋液：取甲醇（chún），用配製完成的樣品稀釋（shì）液按1:4體積比進（jìn）行（háng）稀釋（1份甲醇+4份樣品稀釋液）。

5. 50%甲醇：取甲醇，用去離子水按1:1體積（jī）比進行稀釋（1份無水甲醇+1份去離子水）。

6. 80%甲醇：取甲醇，用去離子水按4:1體積比進行稀釋（4份無水甲醇+1份去離子水）。

【樣本前處理步驟（zhòu）】

一、 穀物（大米、玉米、小米等低脂含（hán）量）（稀釋倍數：8）

1. 取1.0g粉碎的樣品與8ml 穀物稀釋液混合（hé）均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取（qǔ）上清液100μl待測 。

二、 蛋糕（稀釋倍數：10）

1. 取1.0g粉碎（suì）的樣品與4ml 50%甲醇混合均勻；

2. 強力（lì）振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取400μl下層液體，加（jiā）入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋後液體待測（cè） 。

三、 花生、奶油蛋糕（gāo）（稀釋倍數（shù）：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲（jiǎ）醇混（hún）合均勻；

3. 強（qiáng）力振蕩3min；

4. 5000g離心10min；

5. 取400μl下層液（yè）體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

6. 取100μl稀釋後液體待測 。

四、 食用油（稀（xī）釋倍（bèi）數：10）

1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合，振蕩1min；

3. 靜置（zhì）10min；

4. 取（qǔ）400μl下層液體（tǐ），加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋後液體（tǐ）待測 。

五、 飼（sì）料、麵粉、湯圓（稀釋倍數：24）

1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 2000g離心（xīn）10min；

4. 取（qǔ）上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均（jun1）勻；

5. 取100μl稀釋後液體待測。

六、 啤（pí）酒（稀釋倍數：5）

1. 取200μl啤酒樣品（pǐn）（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；

2. 振蕩3min；

3. 取（qǔ）100μl稀釋後液體待（dài）測（cè）。

七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數：8）

1. 取0.5ml樣品（pǐn），加入0.5ml蒸餾水並加入4.0ml三（sān）氯甲烷；

2. 混勻振蕩3min，5000g離心10min；

3. 取1.0ml下層液，60℃氮氣（qì）吹（chuī）幹；

4. 加入100μl乙腈溶解幹燥物，並加入900μl樣品稀釋液，充分混勻；

5. 取100μl稀釋後液體（tǐ）待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用（yòng）之前（qián）將所有試劑和所需板條（tiáo）回溫（20～25℃）。

2. 使（shǐ）用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置2～8℃，幹燥環境保存有利於保（bǎo）持試（shì）劑穩定性。

3. ELISA分析中的再現性，很大程度（dù）上取決於洗板（bǎn）的一致性，正確（què）的洗板操作是ELISA操作中的要點（diǎn）。

4. 在所（suǒ）有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板（bǎn）膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及（jí）微孔（kǒng）板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數量的微孔板，將（jiāng）不用（yòng）的微孔板與（yǔ）幹燥劑一起重新真（zhēn）空密封，放（fàng）置於2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本（běn）和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做（zuò）2孔平行，並記（jì）錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標準（zhǔn）品/樣本50μl到對應的微（wēi）孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜（mó）蓋板後置室溫避光反應15min。

6. 小心揭開蓋板膜（mó），用洗滌（dí）工作液充分洗滌，300μl/孔（kǒng），洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍（pāi）幹。

7. 加入（rù）顯色液100μl/孔，輕（qīng）輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩（dàng）混勻，設（shè）酶標儀於450nm處讀取每孔OD值。

【結果判定】

1. 百分吸光率的計算

標準品或樣本的百分吸（xī）光（guāng）率等（děng）於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以（yǐ）第（dì）一（yī）個標準（0標準（zhǔn））的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/ B0×100%

B—標準溶液或樣本溶液的（de）平均吸光（guāng）度值（zhí）

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度（dù）值

2. 標準曲線的繪製與計（jì）算

以標準品百分吸光率為縱（zòng）坐（zuò）標，黃曲黴（méi）毒素B1標準品濃度（ppb）的對（duì）數為橫坐標，繪製（zhì）標準曲線圖。將樣本的百分（fèn）吸光率代入標準曲線中，從標（biāo）準曲線上讀出樣（yàng）本所對應的濃（nóng）度（dù），乘以其（qí）對（duì）應的稀釋倍（bèi）數即（jí）為樣本（běn）中黃曲（qǔ）黴毒素B1實際含量。

【注（zhù）意事項】

1. 室溫低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標準的（de）OD值偏（piān）低。

2. 在洗板（bǎn）過程（chéng）中如果出（chū）現板孔幹燥的情況，則會出（chū）現標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立（lì）即進行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為0.5M的硫酸（suān），避免接觸皮膚。

5. 不要（yào）使用過了有效期的試劑盒；也不（bú）要摻雜使用（yòng）過了有效期的（de）試劑盒；不要交換使用不同（tóng）批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存於（yú）2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密（mì）封。標準物質和無色的顯色劑對光敏感，因（yīn）此要避（bì）光保存。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑有任何顏色表（biǎo）明顯色劑變質，應當（dāng）棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質（zhì）。

8. 加（jiā）入顯色液（yè）後，一般顯色時間為15～30min。若顏色較（jiào）淺，可延長反應時間到35min（或更（gèng）長），但不得超過40min。反之，則減短反應時（shí）間。

9. 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或（huò）過低將導致檢測吸光度值和靈敏（mǐn）度發（fā）生變（biàn）化。

【樣品最低（dī）檢測限】

    穀（gǔ）物 …………………………………………………0.8ppb

    蛋糕 ……………………………………………………1ppb

    花生、奶油蛋糕 ……………………………………1ppb

    食（shí）用油 …………………………………………………1ppb

    飼料、麵粉、湯圓 ………………………………2.4ppb

    啤酒 …………………………………………………0.5ppb

    醬油（yóu）、醋……………………………………………0.8ppb

【貯藏條件及保（bǎo）存期】

貯藏（cáng）條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。