赭曲黴毒（dú）素A（Ochratoxin A）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

赭曲黴毒素A （Ochratoxin A）是曲黴（méi）屬和青黴屬的真菌形成的次級代謝產物，屬烈性的腎髒毒和肝髒毒（dú），廣（guǎng）泛存在於各種食物中。穀（gǔ）物及其副產品是（shì）赭曲黴毒素（sù）A的主要來源。動物實驗表明攝入了被這種毒素汙染的飼料後（hòu），會發生急性或慢性中毒症。防止汙染赭曲黴毒（dú）素A的食品和飼料直接或間接地進入人類食（shí）物鏈，加強對赭（zhě）曲黴毒素A的檢測十分重要。

【適用範圍】

可定性、定量檢測穀物、飼料、麵粉、啤酒、紅酒、飲料等樣本中的赭曲黴毒素A。

【試（shì）驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預包被赭曲黴毒素A抗原，加入樣本/赭曲（qǔ）黴毒素A標（biāo）準品溶液及辣根過氧化物酶（méi）標記的赭曲黴毒素A抗體（tǐ）。樣本或標準品（pǐn）溶液中（zhōng）的赭曲（qǔ）黴毒素A與預包（bāo）被在微孔板上的（de）赭曲黴毒素A抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的赭曲黴毒素A抗體。未結合的酶標抗體在（zài）洗滌時被除去，再加入顯色液，讀取吸光值。樣本（běn）的吸光（guāng）值與其所含殘留物赭曲黴（méi）毒素A抗原的含量成負相關。對（duì）照標準曲線，即可得（dé）出相應殘（cán）留（liú）物赭曲黴（méi）毒素A的含量。

【試劑盒靈敏度（dù）】

   試劑盒靈（líng）敏度：1ppb

【交叉反應率】

   結構（gòu）類似物                                                          交叉反應（yīng）率

  赭曲黴毒素A   ……………………………………………………………  100%

  赭曲黴毒素B   ……………………………………………………………   43%

  赭曲黴毒素C   ……………………………………………………………     5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶（píng））

0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb

3. 酶標物 1瓶   …………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶   …………………………………… 10ml

6. 濃（nóng）縮洗滌液（10×）1瓶 …………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀（xī）釋液（yè）（10×）1瓶……………… 20ml

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

---微孔板酶標儀450nm

---振蕩器

---粉碎機（jī）

---離心機

---微量天平

---微量移液器：單道 20µl～200µl、200µl～1000µl、多道 300µl

試劑（jì）：

---去離子水（或蒸餾水）

---二氯甲烷

---鹽酸

---NaHCO3

【試劑配製】

1. 樣品稀釋（shì）液：將濃（nóng）縮樣（yàng）品稀（xī）釋液（yè）用去離子水按1:9體積比進（jìn）行稀釋（shì）（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子（zǐ）水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗（xǐ）滌液+9份去離子水）。

【樣品前處（chù）理步驟】

一、穀物與飼料（稀釋倍數：2.5）

1. 稱（chēng）取1g粉（fěn）碎的樣品（pǐn），加（jiā）入0.5ml 0.13M NaHCO3，震蕩1min，

2. 加入2ml樣品稀釋液，震蕩5min；

3. 室溫下，2000g離心15min；

4. 取100μl待測。

二（èr）、果（guǒ）汁、啤酒、飲料（稀釋（shì）倍數：1）

1. 碳酸飲料應去除CO2（60℃水浴或振（zhèn）蕩去除）

2. 取2ml 樣（yàng）品，加入 1ml 1mol/L HCl 振勻，加（jiā）入2ml CH2Cl2 振（zhèn）勻（yún） 3min；

3. 室溫下（xià），3500g離心10min；

4. 去除（chú）上層液，吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液，強烈振蕩3min；

5. 室溫下，3500g離心10min；

6. 取（qǔ）480μl上（shàng）層（céng）液，加入120μl甲醇，振蕩均勻，取100μl待（dài）測。

【檢測步驟】

一、 測（cè）定前須知：

1. 使用之前將所（suǒ）有試劑（jì）和所需（xū）板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置2～8℃，幹燥環境保（bǎo）存有利於保持試劑穩（wěn）定性。。

3. ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的（de）一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的（de）要點。

4. 在所有（yǒu）恒溫（wēn）孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住（zhù）微孔板。

二、操作步（bù）驟（zhòu）：

1. 將所需（xū）試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻（yún）。

2. 取出所需數量的微孔板，將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封，放置於2～8℃。不可（kě）冷（lěng）凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標準品（pǐn）對（duì）應微孔編號，每個樣本和（hé）標準品做2孔平（píng）行，並（bìng）記錄標準孔和樣本孔所（suǒ）在的位置。

5. 加標準品/樣本50µl到對應的微孔中，加入酶標物50µl/孔，輕輕振蕩混勻，用（yòng）蓋板膜蓋（gài）板後置（zhì）室（shì）溫避光反應15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300µl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍幹。

7. 加入顯色液100µl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應15min。

8. 加終止（zhǐ）液50µl/孔，輕輕振蕩（dàng）混勻，設酶標儀於450nm處讀取每孔OD值。

【結（jié）果判定】

1. 百分吸光率的計算

標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百（bǎi）分吸光度值的平均值（雙孔）除以（yǐ）第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶（róng）液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液（yè）的平均吸光度值（zhí）

2. 標準曲線的繪製與計算

以標準品百（bǎi）分吸光率為縱（zòng）坐標，赭曲黴毒素A標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百（bǎi）分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線（xiàn）上（shàng）讀出樣本所對應的濃度，乘以其對（duì）應的稀釋倍數即為樣（yàng）本中赭曲黴毒素A實際量。

【注意事項】

1. 室溫（wēn）低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過（guò）程中如果出現板孔幹（gàn）燥（zào）的情況，則會出現（xiàn）標準曲線不成（chéng）線性，重複性不好的現象。所以洗板（bǎn）拍幹（gàn）後應立即進（jìn）行下一步操作。

3. 每種試劑（jì）使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效（xiào）期的試劑盒；也不（bú）要（yào）摻雜使用過了有效期的（de）試劑盒；不要（yào）交換（huàn）使（shǐ）用不同批號試（shì）劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑（jì）盒保存於2～8℃，不能冷（lěng）凍，將不用（yòng）的微孔板重新真（zhēn）空密封。標準物質和無色的顯色劑對光（guāng）敏感，因此要避光保存（cún）。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑（jì）有任何顏色表明顯色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8. 加入顯色液後，一（yī）般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反（fǎn）應時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應（yīng）時（shí）間。

9. 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸（xī）光度值和靈敏度發生變化。

【樣品最低檢測限】

   穀物、飼料  ……………………………………………  2.5ppb

   果汁、啤酒、飲料  ……………………………………   1ppb

【貯（zhù）藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。