黃曲黴毒（dú）素B1（Ⅱ型）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃曲黴毒素是曲黴菌屬的黃曲黴和寄生曲黴的二次代謝產物，是自然界最危險的致癌物質之一（yī），廣泛（fàn）存（cún）在於穀物、堅果、棉籽以及以此為原料生產的各種食品、油料、酒類、飼料中（zhōng），並能通（tōng）過動物體產生同樣（yàng）有害（hài）的代謝產物，存在於牛奶及奶製品，肉類甚至人體血液，組織中。

黃曲黴毒素中毒性最強的是黃曲黴毒素B1，是世界衛（wèi）生組織規定的I類致癌物質，毒性是砒（pī）霜的68倍，其幾乎一直和黃曲黴毒素B2、G1 和 G2共存，是肝癌的三大致病因素之首。世（shì）界大部分國家（jiā）和地區都已對食品和飼料中的黃曲黴毒素最高允許水平作了規定，因此，準確測（cè）定（dìng）食品及飼料中的黃曲黴毒素含量對（duì）於食品安全監控具有重（chóng）要意義。

【適用範圍】

可定性、定量檢測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料等樣本中（zhōng）的黃曲黴毒素B1。

【試驗原理】

本試（shì）劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預（yù）包被（bèi）黃曲（qǔ）黴毒素（sù）B1抗原（yuán），加（jiā）入樣本/黃曲黴毒素B1標準品溶液及辣根過氧化物酶標（biāo）記的黃曲黴毒素B1抗體。樣本或標（biāo）準品溶液中的黃曲黴毒素B1與預包被（bèi）在微孔板上的黃曲黴毒素B1抗原競爭結（jié）合辣根過氧化物酶標記的黃曲黴毒素B1抗體。未結合的酶標（biāo）抗體（tǐ）在洗滌時被除去（qù）。再加入（rù）TMB顯色液（yè），讀取吸（xī）光值。樣本的吸光值與其所含殘留（liú）物黃曲黴毒素（sù）B1的（de）含量成負相關。對照（zhào）標準曲（qǔ）線，即可得出相應殘留物黃曲黴毒素B1的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.5ppb

【交叉反（fǎn）應率】

   結構類似物                                                                交叉反應率

  黃曲黴毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲黴毒素B2   ……………………………………………………………   15%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………   11%

  黃曲黴（méi）毒素G2   ……………………………………………………………    4%

  黃（huáng）曲黴毒素M1  ……………………………………………………………  0.5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.5ppb, 2ppb, 4ppb, 8ppb,16ppb

3. 酶標物1瓶   ……………………………………………6ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………………12ml

5. 終止液1瓶   …………………………………………10ml

6. 濃（nóng）縮洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………50ml

【需要而未（wèi）提供的設（shè）備及試劑】

設備：

┅┅微孔板（bǎn）酶標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器（可選）

┅┅粉碎機

┅┅離（lí）心機（可選）

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道（dào） 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道（dào）300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純）

┅┅去離子水（或蒸（zhēng）餾水）

【試劑配製】

1. 樣品稀釋液：將濃（nóng）縮樣品稀（xī）釋液用去離子水按1:9體（tǐ）積比進行稀釋（1份濃縮樣（yàng）品稀釋液+9份去離（lí）子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水（shuǐ）按（àn）1:9體積比進行稀釋（1份濃（nóng）縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 70%甲醇水：將甲（jiǎ）醇用去離子（zǐ）水按70:30體積比進行稀釋（7份無水甲醇+3份去離子水）。

【樣本前處理步驟】

花生醬、芝麻醬、蛋黃醬、麵粉、餅幹、蛋糕等食品，各種飼料及花生粕、豆粕、麥麩、DDGS等原料（稀釋倍數：5）

1. 取10g粉碎的樣品與50ml 70%甲醇水混合均勻（可根據提取容器（qì），等比例適量調整樣品量和甲醇水的量）；

2. 高速均質2min或振蕩提取5min；

3. 2000g離心5min或定性濾紙過濾；

4. 取100μl上清液待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知（zhī）：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置2～8℃，幹燥（zào）環境保存有利於（yú）保持試劑（jì）穩定性。

3. ELISA分析（xī）中的再（zài）現（xiàn）性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的（de）洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所（suǒ）有恒溫孵育過程中，避免光線照射。用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數量的微孔板，將不用的微孔板與幹燥劑一起（qǐ）重（chóng）新真空密封，放置（zhì）於2～8℃。不（bú）可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也（yě）需（xū）回溫。

4. 將樣本和標準品對應微孔編號，每個（gè）樣本和標（biāo）準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣（yàng）本孔所在的位置。

5. 每孔中加入60μl樣品稀釋液。

6. 加標準品/樣本30μl到對應的微孔中，加入酶標物（wù）50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後（hòu）置室溫避光反應15min。

7. 小心揭（jiē）開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間（jiān）隔30s，用吸（xī）水紙拍幹（gàn）。

8. 加入（rù）顯色液100μl/孔，輕（qīng）輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應15min。

9. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設（shè）酶標儀於450nm處讀取每孔OD值（zhí）。

【結果判定】

1. 百分吸（xī）光率的計算

標準（zhǔn）品或樣本的百分吸光率等（děng）於（yú）標（biāo）準（zhǔn）品或樣本的百分吸（xī）光度值（zhí）的平均值（雙孔）除以第一個標（biāo）準（0標準）的（de）吸光度值，再乘以100%，即

百分吸（xī）光（guāng）率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

2. 標準曲線（xiàn）的繪（huì）製與計算

以標準品百分（fèn）吸光率（lǜ）為縱坐標，黃曲黴毒素B1標準品濃（nóng）度（ppb）的對數為橫坐標（biāo），繪製標準曲線（xiàn）圖。將（jiāng）樣（yàng）本的百分吸光率代入標準曲（qǔ）線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對（duì）應的稀釋倍數即為樣本中黃曲黴毒素B1實際含量（liàng）。

【注意事項】

1. 室（shì）溫低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2. 在洗（xǐ）板過程（chéng）中如果出現板孔幹燥的情況，則會出現（xiàn）標準曲線不成線性，重複（fù）性不好的（de）現象。所以洗板拍幹後（hòu）應立即進行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反（fǎn）應終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚（fū）。

5. 不要使用過了有效期的試（shì）劑（jì）盒；也不要摻（chān）雜（zá）使用（yòng）過了有效期的試劑盒（hé）；盡量不要（yào）交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件（jiàn）：

試劑盒（hé）保存於2～8℃，不能（néng）冷凍（dòng），將不（bú）用的微孔板（bǎn）重新真空密封。標準物質（zhì）和無色的顯色（sè）劑對光敏感，因此要（yào）避光保存。

7. 試劑變（biàn）質（zhì）的跡象：

顯色（sè）試劑（jì）有任何顏色表明顯色劑變（biàn）質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小（xiǎo）於0.5（A450nm<0.5）時，表（biǎo）示試劑可能變質。

8. 加入顯色（sè）液後，一般顯色時間為15～30min。若（ruò）顏色（sè）較淺，可延（yán）長反應時間到35min（或更長），但不得超（chāo）過40min。反之，則減短反應時間。

9. 該試（shì）劑盒（hé）最佳反應溫度為25℃，溫度過（guò）高或過低將導（dǎo）致檢測吸光（guāng）度值和靈敏度發生變化。

【樣品最低檢測限】

    飼料等……………………………………… 5ppb

【貯藏條件（jiàn）及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存（cún）期：該產品有效期為12個月。