黃曲黴毒素B1（Ⅲ型）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃曲黴毒素（sù）是曲（qǔ）黴菌屬的黃曲黴和寄生曲黴的二次代謝產物，是（shì）自（zì）然界最危險的（de）致癌物質（zhì）之一，廣泛存（cún）在於（yú）穀物、堅果、棉籽以及以此為原料生產的各種食品、油料（liào）、酒類、飼料中，並能通過動物體產（chǎn）生（shēng）同樣有（yǒu）害的代謝產物，存在於牛奶及（jí）奶製（zhì）品，肉（ròu）類甚至人體血液，組織（zhī）中。

黃曲黴毒素中毒性最強（qiáng）的（de）是黃曲黴毒素B1，是世（shì）界（jiè）衛生組織規（guī）定的I類致癌物質，毒性是砒霜的68倍，其幾乎一直和黃曲黴毒素B2、G1 和 G2共存，是肝癌的三大致病因素之首（shǒu）。世界大部分（fèn）國家和地區都已對食品和飼料（liào）中的黃曲黴毒素最高允許水平作了規定，因此，準確測定食品（pǐn）及飼料中的黃曲黴毒素含量對於食品（pǐn）安全監（jiān）控具有重要意（yì）義。

【適用範圍】

可定性、定量檢測嬰兒配方食品，嬰兒輔助食品等（děng）樣本中的（de）黃曲黴毒（dú）素B1。

【試驗原（yuán）理】

本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預包被黃曲黴毒（dú）素B1抗體，加入樣（yàng）本/黃（huáng）曲黴毒素B1標準品溶液及辣根過氧化物（wù）酶標記的黃曲黴毒（dú）素B1抗（kàng）原。樣本或標準品溶液中（zhōng）的黃曲（qǔ）黴毒素B1與辣根過氧化物酶標（biāo）記的黃曲黴毒素（sù）B1抗原競爭結合預（yù）包被在微孔板上的（de）黃曲黴毒素B1抗體。未結合的酶標抗原在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸（xī）光值與其所含殘留物黃曲黴毒素B1的含量成負相關。對照標準曲線，即可得出相應殘（cán）留物黃曲黴毒（dú）素B1的含量。

【試劑（jì）盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：10ppt（0.01ppb）

【交叉反應率】

   結構類似物                                                                交叉反應率

  黃曲黴毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲黴（méi）毒素B2   ……………………………………………………………   15%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………   11%

  黃曲黴（méi）毒素（sù）G2   ……………………………………………………………    4%

  黃曲（qǔ）黴毒素M1  ……………………………………………………………  0.5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液（yè）×6瓶（píng）：（2ml/瓶）

    0ppt,10ppt,20ppt, 40ppt, 80ppt,160ppt

3. 酶標物1瓶   ……………………………………………6ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………………12ml

5. 終止液1瓶（píng）   …………………………………………10ml

6. 濃縮（suō）洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀（xī）釋液（10×）1瓶 ……………………50ml

【需要而未提供的設備及試劑】

設（shè）備：

┅┅微孔板酶（méi）標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅粉碎機

┅┅離心機

┅┅天平：感量（liàng）0.01g

┅┅微量移（yí）液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純（chún））

┅┅去（qù）離子水（或蒸餾水）

【試劑配製】

1. 樣品稀釋液：將（jiāng）濃縮樣品稀釋（shì）液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋（shì）液+9份去（qù）離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃（nóng）縮洗滌液用去離子水按1:9體積（jī）比（bǐ）進（jìn）行稀釋（1份濃（nóng）縮洗滌液+9份去離子水（shuǐ））。

3. 80%甲醇水：將甲醇用去離子水按80:20體積比（bǐ）進行稀釋（8份無水甲醇+2份去離子水）。

【樣（yàng）本前處理步驟】

嬰幼兒配方食品，輔助食品等（稀釋（shì）倍數：24）

1. 取（qǔ）3.0g粉（fěn）碎的樣（yàng）品與9.0ml 80%甲（jiǎ）醇混合均勻；

2. 強力振蕩（dàng）3min；

3. 2000g離心10min；

4. 取上層清液（yè）100μl，加入（rù）700μl樣品稀釋液，混（hún）合均勻；

5. 取100μl稀釋後液體待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用（yòng）之前將所（suǒ）有試劑和（hé）所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試（shì）劑及剩（shèng）餘板條放置2～8℃。

3. ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封（fēng）住微孔（kǒng）板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放（fàng）置室溫（20～25℃）30min以上，液體（tǐ）試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所（suǒ）需數量的微孔板，將不用的微孔板與幹（gàn）燥劑一起重新真空密封，放置於（yú）2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在（zài）使用（yòng）前也需（xū）回溫。

4. 將樣本和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準（zhǔn）孔和樣本孔所在的位置（zhì）。

5. 加標準品/樣本100μl到對應的微孔中，用蓋板膜蓋板（bǎn）後置室溫避光反（fǎn）應15min。

6. 再加入酶（méi）標物50μl/孔（kǒng），輕輕振蕩混勻，用蓋板膜（mó）蓋板後置室溫避光反應5min。

7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板（bǎn）5次（cì），每次間隔（gé）30s，用吸水紙（zhǐ）拍幹。

8. 加入顯色液100μl/孔（kǒng），輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋（gài）板後置室（shì）溫避（bì）光（guāng）反應（yīng）15min。

9. 加終止液50μl/孔，輕（qīng）輕振蕩混勻，設酶標儀於450nm處讀（dú）取每（měi）孔OD值。

【結果判定】

1. 百（bǎi）分吸光率的（de）計算

標準品或樣（yàng）本的（de）百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度（dù）值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或（huò）樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

2. 標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，黃曲黴毒素B1標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將（jiāng）樣本的百分吸光率代（dài）入標準曲線（xiàn）中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其（qí）對應的稀釋倍數即為（wéi）樣本中黃曲（qǔ）黴毒素B1實際含量。

【注意事項】

1. 室溫低於（yú）20℃或試（shì）劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致（zhì）所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過程中（zhōng）如果出現板孔幹燥的（de）情況，則會出現標準曲線不成線性，重複性不好（hǎo）的現象。所以洗板（bǎn）拍幹後應立即進（jìn）行下一步操作。

3. 每種試劑使（shǐ）用（yòng）前（qián）均需搖勻。

4. 反應終止液為（wéi）0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期（qī）的試劑盒；不要交換使用不同（tóng）批號試劑盒中的試（shì）劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存（cún）於2～8℃，不能冷凍，將不用（yòng）的微孔板重新真空密封。標準物質和（hé）無色的顯色劑對光（guāng）敏感（gǎn），因此要避光保存。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑有任何顏色（sè）表明顯色劑（jì）變（biàn）質，應當棄之。0標準的吸光（guāng）度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8. 加入顯色液後，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺（qiǎn），可（kě）延長（zhǎng）反應時間到35min（或更長），但不得超過40min。反（fǎn）之，則減短反（fǎn）應時間。

9. 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低（dī）將導致檢測吸光度（dù）值和靈敏度發生變化。

【樣品檢測範圍】

   嬰幼兒（ér）配（pèi）方食品、嬰幼兒輔助食（shí）品………………………………………0.24ppb — 3.84ppb

【貯藏條件及保存期（qī）】

貯藏條件（jiàn）：保存試劑盒於2～8℃。

保存（cún）期：該產品有效期為12個月。