黃曲黴毒素（sù）M1（Ⅰ型（xíng））ELISA檢（jiǎn）測試劑（jì）盒說明書

【概（gài）要】

黃曲黴毒素是一類真菌（如黃曲黴和寄生曲黴）的有（yǒu）毒的代謝產物，它們具有（yǒu）很強的致癌（ái）性，主要存在於穀物、堅果、棉籽以及一些與（yǔ）人類血液，動物飼料相關的（de）產品中。黃曲黴毒素M1是黃曲黴毒素B1的羥基化代謝產物，也是一種強致癌物質。牛乳及其製（zhì）品是易受（shòu）到黃曲黴毒素M1汙染的食品之一。Aflatoxin M1的檢測方法（fǎ）有高效液相（xiàng）色譜法(HPLC)，薄（báo）層層析法(TLC)等。而使用黃曲（qǔ）黴毒素M1 ELISA試劑（jì）盒（hé）則能夠（gòu）快速而準確的分析樣品中黃曲黴毒（dú）素M1殘留。

【適用範圍】

可定性、定量檢測牛奶，奶粉等樣本中的黃曲黴毒素（sù）M1的含（hán）量（liàng）。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預包被黃曲黴毒素抗原，加入樣本/黃曲黴毒（dú）素M1標準（zhǔn）品溶液及辣根（gēn）過氧化物（wù）酶標記的黃曲黴毒素（sù）M1抗體（tǐ）。樣本或標準品溶液中的黃曲黴毒素M1與預包被（bèi）在微孔板上（shàng）的黃曲黴毒素抗原（yuán）競爭結合（hé）辣（là）根過氧（yǎng）化物酶標記的黃曲黴毒素M1抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再（zài）加（jiā）入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲黴毒素M1的含（hán）量成（chéng）負相關（guān）。對照標（biāo）準（zhǔn）曲線，即可得出相應殘（cán）留物黃曲黴毒素M1的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏（mǐn）度：0.1ppb

【交叉反應率】

   結構類似物                                                              交（jiāo）叉反應率

  黃曲黴毒素B1   ……………………………………………………………  30%

  黃曲黴毒素（sù）B2   ……………………………………………………………   5%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………  15%

  黃曲黴毒素G2   ……………………………………………………………   7%

  黃（huáng）曲黴（méi）毒素M1  …………………………………………………………… 100%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準（zhǔn）液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 濃縮酶標記（jì）物 1瓶  ………………………………… 1ml

4. 酶標稀釋液1瓶   …………………………………… 7ml

5. 顯色液1瓶  …………………………………………  12ml

6. 終止液1瓶（píng）  …………………………………………  10ml

7. 濃縮洗滌液（yè） （10×）1瓶 ………………………  50ml

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

┅┅微孔板酶標（biāo）儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅離心機

┅┅天平：感（gǎn）量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl，八道 300μl

試劑：

┅┅去離子（zǐ）水

【試劑配製】

1. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液（yè）用去離子水按1:9體積比進行（háng）稀釋（1份濃縮洗滌液（yè）+9份去離子水）。

2. 酶標物的配製(現用現（xiàn）配，避光保存)：將濃縮酶標記物與酶標稀釋液按1：19體積比進行稀釋（1份酶（méi）濃縮液+19份酶標稀釋液。

【樣本（běn）前處理步驟】

一、 牛奶（稀釋倍數：1）

1. 取（qǔ）待（dài）測樣品，7000rpm室溫下離心，5min；

2. 取下（xià）層100μl待測。

二、 奶粉（稀釋倍數：5）

1. 取1.0g奶粉，加入5ml去離（lí）子水，混勻；

2. 7000rpm室溫下離（lí）心，5min；

3. 取下層100μl待測。

【檢測步驟】

一、測定前須知：

1. 使用之前（qián）將（jiāng）所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使（shǐ）用之後立即將所有試劑及剩餘板條放（fàng）置2～8℃。

3. ELISA分析中的（de）再現（xiàn）性，很大程度上取決於洗（xǐ）板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中（zhōng），避免光線照射，用蓋板膜封住微孔（kǒng）板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔（kǒng）板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用（yòng）前均須（xū）搖勻。

2. 取出（chū）所（suǒ）需數量的微孔板，將不用的（de）微孔板與幹燥劑一起（qǐ）重新真空密封，放置於2～8℃。不可（kě）冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和（hé）樣本孔所在的（de）位置。

5. 加標（biāo）準品/樣本50μl到對應（yīng）的微孔中，加入酶標物50μl/孔（kǒng），輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應30min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍幹。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應30min。

8. 加終（zhōng）止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶標儀於450nm處讀取每孔OD值。

【結（jié）果判（pàn）定】

1. 百分吸光率的計算

標準（zhǔn）品或（huò）樣本的百分吸光率等於標（biāo）準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的（de）吸（xī）光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準（zhǔn）溶液或（huò）樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸（xī）光度值

2. 標準曲線的繪製與計算

以（yǐ）標準品百（bǎi）分吸（xī）光率為縱坐標，黃曲黴毒素M1標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸（xī）光率代入標準曲（qǔ）線中，從標準曲線上讀（dú）出樣本所（suǒ）對應的濃度，乘以其對應（yīng）的稀釋倍數即為樣本中（zhōng）黃曲黴毒素M1實際含量。

【注意事項】

1. 室溫低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現板（bǎn）孔幹燥的情（qíng）況，則會出現標準曲（qǔ）線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下（xià）一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應終（zhōng）止（zhǐ）液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要（yào）使用過了有效期的試劑盒；也（yě）不要摻雜使用過了有效期的試劑（jì）盒；不（bú）要交換使用不（bú）同批號試劑盒中的試劑（jì）。

6. 儲存條件：

試（shì）劑盒保存於2～8℃，不能冷凍（dòng），將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無（wú）色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑（jì）變質的跡象：

顯色試劑有任何顏（yán）色表明顯色劑變質，應當棄之。0標準的吸光（guāng）度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能（néng）變質。

8. 加（jiā）入顯色液（yè）後（hòu），一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺（qiǎn），可延長反應（yīng）時間到35min（或更（gèng）長），但不得（dé）超過40min。反之，則減（jiǎn）短（duǎn）反應時間。

9. 該（gāi）試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度（dù）值和靈（líng）敏度（dù）發（fā）生變化。

【樣品最低檢測限】

    牛奶………………………………………………0.1ppb

    奶粉………………………………………………0.5ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件（jiàn）：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。