黃曲黴毒素M1（Ⅱ型）高靈敏度ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃曲黴毒素是一類真菌（如黃（huáng）曲黴（méi）和寄（jì）生曲黴）的（de）有毒的代謝產物，它們（men）具有很強的致癌性，主要存在於穀物、堅果、棉籽（zǐ）以及一些與人類血（xuè）液，動物飼料相關的產（chǎn）品中。黃曲黴毒素M1是黃（huáng）曲黴毒素B1的羥基（jī）化代謝產物，也是（shì）一種強致癌物質。牛乳及其製品是易受到（dào）黃曲黴毒素M1汙染的食品之一。Aflatoxin M1的檢測方法有高效液相色（sè）譜法（fǎ）(HPLC)，薄層層析法(TLC)等。而（ér）使用黃曲（qǔ）黴毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確（què）的分析樣品中黃曲黴毒素M1殘留。

【適用範（fàn）圍】

可定性、定（dìng）量檢（jiǎn）測（cè）牛奶，奶粉等樣本中的黃曲黴毒素M1的含量（liàng）。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預包被黃曲黴毒素抗原，加入樣本/黃曲黴毒素M1標準品溶液及辣根過（guò）氧（yǎng）化（huà）物酶標記的黃曲黴毒素M1抗（kàng）體。樣本或標準品溶液中的黃曲黴毒素M1與預包被在微孔板上的黃曲黴毒素抗原競爭結合辣根（gēn）過氧化物酶標記的黃曲黴毒素M1抗體。未結（jié）合的酶標（biāo）抗體在洗滌（dí）時被除去。再（zài）加入TMB顯色液（yè），讀（dú）取吸光值。樣本的吸光（guāng）值與其所（suǒ）含殘留物黃曲黴毒素M1的含量成（chéng）負相關。對照（zhào）標準曲線，即可得出相應殘留物黃曲黴毒素M1的含量。

【試（shì）劑（jì）盒靈敏度】

   試劑盒（hé）靈敏度：0.02ppb

【交叉反應率】

   結構類似物                                                                 交叉反應率

  黃（huáng）曲黴（méi）毒素B1   ……………………………………………………………  30%

  黃曲黴毒素B2   ……………………………………………………………   5%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………  15%

  黃曲黴毒素G2   ……………………………………………………………   7%

  黃曲黴毒素M1  …………………………………………………………… 100%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊  

2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppt, 20ppt, 50ppt, 100ppt, 250ppt, 500ppt

3. 濃縮酶標記物 1瓶  …………………………………… 1ml

4. 酶標（biāo）稀釋液1瓶 ………………………………………… 7ml

5. 顯色液1瓶（píng）  …………………………………………… 12ml

6. 終止液1瓶  …………………………………………… 10ml

7. 濃縮樣本稀釋液（20×）1瓶 …………………… 50ml

8. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml

【需要而未提供的設備及（jí）試劑】

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅振蕩（dàng）器

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl， 八道（dào） 300μl

試劑（jì）：

┅┅去離子水（或蒸餾水）

【試劑配製】

1. 洗滌工作（zuò）液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水（shuǐ））。

2. 酶標物的配（pèi）製(現用現配，避光（guāng）保存)：將濃縮酶標記物與酶標稀釋液按1：19體積比進行稀釋（1份酶濃縮液+19份酶標稀釋液）

【樣本前處理（lǐ）步驟】

一、 牛奶（稀釋倍數：1）

1. 取待測樣（yàng）品7000rpm室溫下離心，10min；

2. 取200ul下層待測（cè）。

二、 奶粉（稀釋倍數：5）

1. 取2.0g奶粉，加（jiā）入10ml樣（yàng）本（běn）稀釋液，混勻；

2. 7000rpm室溫下離心，10min；

3. 取（qǔ）下層200μl待測。

【檢測步驟】

一、測定前須知（zhī）：

1. 使用之前（qián）將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放（fàng）置2～8℃。

3. ELISA分析中的（de）再現性，很大程度上取決於洗板（bǎn）的一致性，正確的洗板操作（zuò）是ELISA操作（zuò）中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板（bǎn）。

二、操作（zuò）步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置（zhì）室溫（wēn）（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所（suǒ）需數量的微孔板，將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封，放置於2～8℃。不可冷凍。

3. 洗（xǐ）滌（dí）工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本（běn）和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行（háng），並記錄標準（zhǔn）孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標準品/樣本100μl到對應的（de）微孔中，輕輕振蕩（dàng）混勻，用蓋板膜蓋板後置（zhì）室溫避光反應30min。

6. 小心揭開蓋板膜，加入酶標（biāo）物50μl/孔，用蓋板膜蓋板後置室溫避（bì）光（guāng）反（fǎn）應5min。

7. 小心揭開蓋板（bǎn）膜，用洗（xǐ）滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次（cì）間隔30s，用吸水紙拍幹。

8. 加入顯（xiǎn）色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避（bì）光反應（yīng）30min。

9. 加終（zhōng）止液（yè）50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶標儀（yí）於450nm處讀取每（měi）孔OD值（zhí）。

【結果判（pàn）定】

1. 百分吸光率的計算

標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（zhí），再乘以100%，即

百分吸光（guāng）率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶（róng）液（yè）的平均吸光度值

2. 標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，黃曲黴毒素M1標準品濃度（dù）（ppb）的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百（bǎi）分（fèn）吸光率代入標準曲線中，從標（biāo）準曲線上（shàng）讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為（wéi）樣本中黃曲黴毒素M1實際含量。

【注意（yì）事項】

1. 室溫低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標（biāo）準的OD值（zhí）偏低。

2. 在洗板過程中（zhōng）如果出現板孔幹燥的情況，則會出現標準曲線不成線性（xìng），重複性不好的現象。所以洗板拍幹（gàn）後應立即進行下一（yī）步（bù）操作。

3. 每種試（shì）劑使用前均需搖勻。

4. 反應終（zhōng）止液為0.5M硫酸，避免接觸（chù）皮膚。

5. 不要使用（yòng）過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效（xiào）期（qī）的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑（jì）盒（hé）中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存於2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空（kōng）密封。標（biāo）準物質和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小（xiǎo）於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變（biàn）質。

8. 加入顯色液後（hòu），一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反（fǎn）應時間到（dào）35min（或更（gèng）長），但不得超過40min。反之，則減短反應時間。

9. 該試劑（jì）盒最佳反應溫度（dù）為25℃，溫（wēn）度過高（gāo）或過低將導致檢測吸光度值（zhí）和靈敏度（dù）發生變化。

【樣品最低檢測限】

    牛奶 ………………………………………………… 0.02ppb

    奶粉 …………………………………………………  0.1ppb

【貯藏（cáng）條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。